骨重塑在造血干細胞動員中的機制及應用研究.pdf

1、本研究分為兩部分：
　　 第一部分：
　　 目的：骨髓中大多數(shù)造血干細胞位于骨組織構成的骨盒中。成骨細胞是骨內膜表面的內襯細胞，生理條件下HSC及移植后歸巢至骨髓的HSC與之密切接觸，這種解剖定位提示成骨細胞可能調節(jié)HSC的功能。這一觀點首先在成骨細胞和HSC的體外共培養(yǎng)中得到證實，隨即一系列的研究幾乎同時確定:成骨細胞是HSC完中一關鍵組成成分，目前人們將之命名為‘成骨細胞盒’或‘骨內膜完’。通過調節(jié)‘骨內膜完’的大小

2、，可以控制HSC的數(shù)量，維持HSC的穩(wěn)定狀態(tài)’。本研究以干細胞動員中的成骨細胞及破骨細胞為研究對象，觀察干細胞動員過程中成破骨細胞數(shù)量和功能的變化及其與動員的關系，進一步研究造血干細胞動員的機制。
　　 方法：利用流式細胞術檢測動員0,3,5天小鼠外周血干細胞數(shù)量，評價動員效果;通過實時定量PCR的方法比較動員0,3,5天小鼠成骨細胞特異性基因OCN,OPN,SDF-1,SCF的水平;并通過免疫組化及流式細胞術比較動員0,3,5

3、天人類及小鼠成骨細胞數(shù)量功能的差異:利用細胞化學TRACP染色的方法比較動員0,3,5天小鼠破骨細胞數(shù)量和功能的差異;利用連續(xù)切片標記Caspase3的方法檢測人類及小鼠成骨細胞的凋亡情況;利用ELISA的方法檢測人類及小鼠循環(huán)中OCN,TRAP-5b蛋白水平反應成破骨細胞活性;共培養(yǎng)小鼠成骨細胞和小鼠骨髓有核細胞，檢測成骨細胞活性。
　　 結果：
　　 1.短期應用G-CSF可導致人類和小鼠動員模型中干髓端成骨細胞數(shù)量

4、減少活性下降:動員前小鼠成骨細胞OCNmRNA水平為動員第三天的27±6倍(0.0l);且動員后第3天骨內膜成骨細胞數(shù)量明顯減少，形態(tài)由立方形變?yōu)樗笮?CD45-Terl19-OPN"成骨細胞數(shù)量在動員后3天及5天明顯減少(動員前，4085±135cells/femur;動員后3天，1118±80cells/femur;動員后5天，1032±55cells/femur;P=0.02);動員3天和5天成骨細胞活性明顯下降，OCN水平分別為

5、59.44±3.16ng/ml(動員前)，39.21±4.49ng/ml(動員后第3天)，42.36±2.23ng/ml(動員后第5天)，f0.O1。進一步檢測正常供者和自體移植患者標本同樣顯示動員后成骨細胞數(shù)量減少并伴有活性下降。然而在小鼠G-CSF動員第3天外周血LSK細胞比例并未明顯增加，動員前、動員3天及動員5天分別為0.40±07％,0.55±0.05％和2.9±0.32％，因此成骨細胞的變化發(fā)生于動員之前。
　　 2

6、.成骨細胞數(shù)量減少導致SDF-1,SCF,OPN等蛋白表達的減少，動員前小鼠成骨細胞SDF-1mRNA的表達水平為動員后員的發(fā)生。3天的3.44±0.3倍，進而引起動.
　　 3.G-CSF誘導的成骨細胞數(shù)量減少功能下降部分是由于動員過程中成骨細胞發(fā)生了凋亡，但成骨細胞的分化并未受到抑制，供者血清DKKl水平在動員前和動員后5天并無明顯差異，13621.13±1081.99pg/ml和10079.83±2055.82pg/ml,

7、P=0.220。
　　 4.共培養(yǎng)成骨細胞和骨髓有核細胞發(fā)現(xiàn)，加或不加G-CSF兩組成骨細胞OCNmRNA表達情況無明顯差別，0.69oCr-CSF通過間接途徑抑制成骨細胞。
　　 5.動員后3天供者(動員前5.04±0.43U/L，動員后3天3.45±0.37U/L,0.03)及小鼠(動員前5.43±1.2U/L，動員后3天4.04±0.86U/L,P=0.47)血清TRAP-5b水平稍有下降，隨后血清TRAP-5b水

8、平明顯上升(供者動員前為5.04±0.43U/L，動員后5天為6.87±0.57U/L,P-'-0.04;小鼠動員前5.43±1.2U/L，小鼠動員后5天13.0611.65,P=0.02)。動員過程中破骨細胞的活性逐漸增強。
　　 結論：動員過程中成骨細胞數(shù)量活性的下降導致了動員的發(fā)生，并伴隨有破骨細胞的活化。
　　 第二部分：
　　 目的：造血干細胞移植不僅是惡性血液病、嚴重免疫系統(tǒng)疾病及部分實體腫瘤主要甚至

9、唯一的治愈手段，而且隨著對干細胞及其細胞和組織工程研究的深入，正逐漸應用到心腦血管疾病、神經系統(tǒng)疾病等領域。
　　 我們在第一部分的研究中證明了骨重塑在造血干細胞動員過程中發(fā)揮了重要的作用，在第二部分的研究中我們用6種小鼠模型模擬臨床上的自體干細胞移植過程，研究應用甲狀旁腺激素(PTH)或NF-KB配體的受體(RANKL)靶向于成骨細胞或破骨細胞是否能夠增加干細胞數(shù)量，保護干細胞造血重建的功能。
　　 方法：利用細胞毒藥

10、物CTX處理小鼠，建立貧動員模型，進行造血干祖細胞培養(yǎng)，比較正常動員和貧動員小鼠模型中干細胞功能，并利用流式計數(shù)、RQ-PCR,ELISA的方法檢測貧動員小鼠成骨細胞數(shù)量和功能。模擬臨床自體移植過程，用PTH,RANKL干預貧動員小鼠〔具體分組見材料與方法圖1)，利用競爭性移植模型(CRA)檢測不同用藥組小鼠干細胞移植16周后外周血中CD45.2陽性細胞比例。
　　 結果：
　　 1.多次細胞毒藥物化療嚴重影響了成骨細胞

11、和造血干細胞功能:自體干細胞移植患者化療后血清OCN水平明顯下降(化療前:22.19±1.08ng/mL和化療后:16.08±2.12ng/mL,P=0.O1)，小鼠模型中同樣證明了上述觀點，成骨細胞數(shù)量在多次應用細胞毒藥物小鼠中明顯減少，功能下降。且多次應用細胞毒嚴重影響了造血干祖細胞功能。CTLs/Gs組小鼠集落形成實驗結果分別為21.16±1.35U,和13.00±1.71U，正常未用藥小鼠為29.17±1.22U，三者相比P=0

12、.010。
　　 2.骨髓CRA結果顯示給予G-CSF支持的小鼠干細胞功能明顯下降((G組比CTL組，Pte.O1)。然而，應用PTH后可顯著改善該組小鼠干細胞造血重建的功能(PTH組比G組，F(xiàn)RO.O1;PTH組比CTL組，P<0.05)。外周血CRA結果同樣證明應用G-CSF支持治療的G組小鼠僅有極少數(shù)周血干細胞能進行造血重建((G組比CTL組，F(xiàn)RO.05)。而應用PTH的P+G組小鼠外周血干細胞造血重建的能力明顯增加(P

13、+G組比G組，f0.O1;P+G組比CTL組，P<0.05)。與CTL組或G組相比，P+R及P+R+G組周血干細胞同樣顯示出了更強的林髓系造血重建能力。RANKL同G-CSF一樣可有效地動員骨髓中的造血干細胞(P+G組比P+R組，PLO.05)因此，應用PTH和RANKL可增加小鼠模型中動員至外周血中的造血干細胞數(shù)量并且保護多次應用細胞毒藥物后造血干細胞功能。
　　 結論：靶向于骨兔的藥物可有效地改善多次應用細胞毒藥物，尤其是聯(lián)