基于氧化石墨烯和端粒酶的新型生物傳感技術(shù)的研究與應(yīng)用.pdf

1、近年來(lái)，納米材料由于其獨(dú)特的光學(xué)和電化學(xué)性能，已成為當(dāng)前研究的焦點(diǎn)，納米材料也在生物傳感器的研究中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。納米材料與生物傳感器的結(jié)合，涉及到生物技術(shù)、信息技術(shù)、納米科學(xué)等多個(gè)學(xué)科，因此納米材料在生物傳感器中的研究為許多基礎(chǔ)研究提供了許多創(chuàng)新性的研究思路，同時(shí)對(duì)臨床檢測(cè)、醫(yī)學(xué)診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域有著重要影響，也得到了前所未有的發(fā)展機(jī)遇。本文利用納米材料氧化石墨烯和金納米顆粒，開(kāi)發(fā)了一系列成本低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高的新型納米生

2、物傳感技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)核酸、蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)和抗癌藥物的篩選。此外，針對(duì)當(dāng)前癌癥標(biāo)志物端粒酶檢測(cè)方法中存在的靈敏度較低、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，容易出現(xiàn)假陰性信號(hào)等問(wèn)題，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已發(fā)展的方法和技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一些新穎的生物傳感策略用于端粒酶的靈敏檢測(cè)。其主要內(nèi)容如下：
　　(1)在第2章中發(fā)展了一種新型的基于核酸外切酶Ⅲ輔助目標(biāo)循環(huán)放大的生物傳感策略用于目標(biāo)DNA高靈敏的檢測(cè)。在這種方法中，設(shè)計(jì)了一條標(biāo)記有熒光基團(tuán)的發(fā)夾狀信號(hào)探針，其3

3、’末端突出了7個(gè)堿基，此時(shí)核酸外切酶Ⅲ不能水解信號(hào)探針，信號(hào)探針吸附在氧化石墨烯表面上，熒光被氧化石墨烯猝滅。當(dāng)存在目標(biāo)DNA時(shí)，目標(biāo)DNA的5’末端與信號(hào)探針的3’末端雜交，形成雙鏈結(jié)構(gòu)的平齊末端，從氧化石墨烯表面上解離下來(lái)，熒光得到恢復(fù)，而核酸外切酶Ⅲ會(huì)從3’末端開(kāi)始水解信號(hào)探針，而目標(biāo)DNA的3’末端突出了6個(gè)堿基，目標(biāo)DNA不會(huì)被核酸外切酶Ⅲ水解，被釋放出來(lái)進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)反應(yīng)，繼續(xù)與發(fā)夾狀信號(hào)探針雜交，然后信號(hào)再被核酸外切酶Ⅲ水

4、解，這樣目標(biāo)DNA就可以得到循環(huán)利用。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)DNA的高靈敏、高特異性檢測(cè)，響應(yīng)動(dòng)態(tài)范圍為1 pM到50 nM，檢測(cè)下限可達(dá)1 pM，比傳統(tǒng)的DNA檢測(cè)方法要低3個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)該方法具有較好的堿基錯(cuò)配識(shí)別能力。
　　(2)在第3章中建立了一個(gè)基于氧化石墨烯的通用的生物傳感平臺(tái)用于抗癌藥物的篩選。該方法以人類端粒DNA的重復(fù)序列為模板設(shè)計(jì)了一條標(biāo)記有熒光的信號(hào)探針，信號(hào)探針會(huì)吸附在氧化石墨烯表面，從而猝滅熒光。當(dāng)目標(biāo)藥物出

5、現(xiàn)時(shí)，信號(hào)探針上的堿基與中藥單體之間通過(guò)π-π共軛作用和氫鍵作用形成分子內(nèi)反平行的G-四股螺旋復(fù)合結(jié)構(gòu)，從而使信號(hào)探針從氧化石墨烯表面上解離下來(lái)，熒光信號(hào)得到恢復(fù)，進(jìn)而達(dá)到對(duì)抗癌抗腫瘤藥物篩選的目的。該方法對(duì)三類傳統(tǒng)中藥單體進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酮類中藥單體能與信號(hào)探針形成G-四股螺旋復(fù)合結(jié)構(gòu)，是一種潛在的抗癌藥物，同時(shí)該方法在發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　(3)為了進(jìn)一步拓寬氧化石墨烯的應(yīng)用領(lǐng)域，在第4章中，利用

6、氧化石墨烯優(yōu)越的負(fù)載能力，構(gòu)建了一個(gè)通用的生物傳感平臺(tái)用于蛋白水解酶的檢測(cè)，并用于活細(xì)胞內(nèi)蛋白水解酶的成像分析。這種生物傳感技術(shù)利用共價(jià)交聯(lián)的方法，將多肽信號(hào)探針固定到氧化石墨烯的表面，達(dá)到降低背景熒光的目的。當(dāng)目標(biāo)蛋白水解酶存在時(shí)，蛋白水解酶特異性地水解多肽信號(hào)探針，熒光基團(tuán)從氧化石墨烯表面解離下，遠(yuǎn)離氧化石墨烯，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。在這種方法中，氧化石墨烯一方面作為熒光猝滅劑，用來(lái)猝滅信號(hào)探針的熒光，另一方面，氧化石墨烯又作為多肽信號(hào)

7、探針的優(yōu)良載體，將多肽信號(hào)探針運(yùn)送到腫瘤細(xì)胞的內(nèi)部。當(dāng)腫瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)產(chǎn)生目標(biāo)蛋白水解酶時(shí)，蛋白水解酶特異性地水解固定在氧化石墨烯表面的多肽信號(hào)探針，從而產(chǎn)生熒光成像信號(hào)。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)蛋白水解酶caspase-3的靈敏、快速檢測(cè)，其線性范圍在7.25 ng/mL到362 ng/mL之間，同時(shí)也具有較好的選擇性，此外還可實(shí)現(xiàn)對(duì)多元目標(biāo)蛋白水解酶的同時(shí)檢測(cè)。
　　(4)在第5章中，利用金納米顆粒具有優(yōu)越的熒光猝滅能力，建立了一種新

8、穎的生物傳感技術(shù)用于腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的檢測(cè)。該方法先將信號(hào)和巰基捕獲探針退火雜交形成雙鏈DNA，再將雙鏈DNA自組裝到金納米顆粒表面，得到DNA-納米金探針。巰基捕獲探針的3’端包含端粒酶擴(kuò)增的引物序列，在目標(biāo)端粒酶存在的條件下，引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與捕獲探針上的互補(bǔ)序列形成分子內(nèi)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，將信號(hào)探針置換下來(lái)，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)目標(biāo)端粒酶的靈敏檢測(cè)，動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為100到30000個(gè)HeLa細(xì)胞，并且當(dāng)HeLa細(xì)胞在

9、0到1600個(gè)范圍內(nèi)時(shí)，熒光強(qiáng)度與HeLa細(xì)胞的個(gè)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。此外該傳感技術(shù)還可用于二價(jià)鉛離子高靈敏、高特異性的檢測(cè)，檢測(cè)下限可達(dá)2 nM。
　　(5)在第6章中，制備了一種基于構(gòu)象變換的電化學(xué)DNA生物傳感器用于腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的檢測(cè)。該方法將3’端包含了端粒酶擴(kuò)增引物序列的捕獲探針組裝到金電極表面，再將二茂鐵標(biāo)記的信號(hào)探針與捕獲探針的5’端雜交。在目標(biāo)端粒酶的作用下，引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物使得捕獲探針由線型轉(zhuǎn)換成

10、發(fā)夾結(jié)構(gòu)，通過(guò)捕獲探針的構(gòu)象變換，二茂鐵標(biāo)記的信號(hào)探針遠(yuǎn)離電極表面，從而使得電化學(xué)信號(hào)減弱。這種方法成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的靈敏檢測(cè)，動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍為100到60000個(gè)HeLa細(xì)胞，并且在該范圍內(nèi)峰電流信號(hào)與HeLa細(xì)胞個(gè)數(shù)的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，同時(shí)該方法具有較高選擇性，線性范圍寬，高特異性等優(yōu)點(diǎn)。
　　(6)在第7章中，開(kāi)發(fā)了一種基于T7核酸外切酶輔助目標(biāo)循環(huán)的放大方法用于腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性的高靈敏檢測(cè)。在該方

11、法中，設(shè)計(jì)了一條5’標(biāo)記有熒光素(FAM)和中間標(biāo)記有四甲基羅丹明(TAMRA)的Taqman探針，由于T7核酸外切酶對(duì)單雙鏈DNA具有較好的區(qū)分能力，幾乎不水解單鏈狀態(tài)的DNA，因此，在沒(méi)有目標(biāo)端粒酶時(shí)，單鏈狀態(tài)的Taqman探針不被水解，體系的背景信號(hào)也很低。此外，T7核酸外切酶是從雙鏈DNA的5’端開(kāi)始水解DNA，所以引物3，端的擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)被水解，從而得到進(jìn)一步的循環(huán)利用，大大提高了目標(biāo)檢測(cè)的靈敏度。該方法成功地實(shí)現(xiàn)了對(duì)端粒酶活