基于氧化石墨烯和陽離子共軛聚合物的端粒酶活性分析.pdf

1、端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白酶，具有反轉(zhuǎn)錄活性。端粒酶與端粒DNA結(jié)合后，會(huì)以自身RNA序列為模板，進(jìn)行不斷的復(fù)制，阻止端粒DNA在細(xì)胞分裂過程中造成的末端縮短。端粒酶在人的正常細(xì)胞中很難被檢測(cè)到活性，它一般在腫瘤或癌細(xì)胞中被激活。腫瘤或癌細(xì)胞的強(qiáng)大活性與端粒酶被激活密切相關(guān)。通過檢測(cè)端粒酶活性可以實(shí)現(xiàn)腫瘤或癌癥的早期診斷，同時(shí)對(duì)開發(fā)以端粒酶為靶標(biāo)分子的抗癌藥物具有重要意義。本文分別利用氧化石墨烯和陽離子共軛聚合物，結(jié)合恒溫

2、指數(shù)擴(kuò)增和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)兩種信號(hào)放大技術(shù)，建立了系列端粒酶活性檢測(cè)的方法。主
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴端粒酶延伸產(chǎn)物是具有-(ggttag)n重復(fù)序列的DNA。設(shè)計(jì)一條與兩個(gè)重復(fù)序列相匹配的特異性的DNA探針-(ctaacc)2使其與端粒酶延伸產(chǎn)物雜交，形成雙鏈DNA。過量的DNA探針被磁性石墨烯吸附，通過磁分離去除。利用恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)（IEXPAR）對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物捕捉的DNA探針進(jìn)行快速的擴(kuò)增。用與雙鏈DNA特異性結(jié)合的SY

3、BR Green I染料對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。在最優(yōu)條件下，可以檢測(cè)到低至50個(gè)癌細(xì)胞中的端粒酶活性。實(shí)現(xiàn)了恒溫?cái)U(kuò)增條件下端粒酶活性的高靈敏度檢測(cè)。⑵基于陽離子共軛聚合物（PFP）與熒光染料SYBR Green I（SG）之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，建立了一種簡單快速的端粒酶活性檢測(cè)方法。當(dāng)端粒酶存在時(shí)，引物探針被延伸，生成具有-(ggttag)n重復(fù)序列的DNA。然后通過鏈霉親合素與生物素的特異性作用將端粒酶延伸產(chǎn)物連接在磁性微球上

4、。加入與端粒酶延伸產(chǎn)物匹配的探針-(ctaacc)2。端粒酶延伸產(chǎn)物形成雙鏈結(jié)構(gòu)之后加入SG。SG能夠特異性的嵌入到DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中。最后，加入PFP。PFP通過靜電作用與雙鏈DNA結(jié)合，與嵌入在雙鏈結(jié)構(gòu)中的SG發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）。因此，根據(jù)FRET的效率可以實(shí)現(xiàn)對(duì)端粒酶活性的定量檢測(cè)。該方法可以檢測(cè)到30萬個(gè)Hela細(xì)胞中提取的端粒酶活性。為了進(jìn)一步提高方法的靈敏度，我們將該方法與雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信