基于連接酶鏈式反映和陽離子共軛聚合物高靈敏度均相檢測Microrna.pdf

1、MicroRNA(miRNA)廣泛存在于動植物的組織細胞內(nèi),扮演著基因轉(zhuǎn)錄后信使RNA(mRNA)的調(diào)控者的角色。相關(guān)研究表明,一些 miRNA的特異性異常表達與癌癥有著密不可分的聯(lián)系。因此,高靈敏度檢測 miRNA對于進一步研究 miRNA的調(diào)控機制和由miRNA引發(fā)的一系列內(nèi)源性疾病具有非常實際的意義。
　　由于miRNA在細胞內(nèi)的表達量極低,所以通常采用核酸擴增技術(shù)將其檢測信號放大,進而對其進行定性和定量分析。但是,傳統(tǒng)的指

2、數(shù)核酸擴增方法,如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)具有引物設(shè)計復(fù)雜、檢測靈敏度不高以及特異性較差等缺點。連接酶鏈式反應(yīng)(LCR)作為另一種指數(shù)核酸擴增方法,一般需用聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分離才能實現(xiàn)核酸的定性和半定量分析,大大延長了檢測時間,降低了檢測效率。
　　本文結(jié)合連接酶鏈式擴增反應(yīng)和lambda核酸外切酶協(xié)助的陽離子共軛聚合物熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù),建立了一種高靈敏度均相檢測miRNA的新方法。方法設(shè)計兩對LC

3、R探針,每對探針含有一條3?端熒光標記和5?端磷酸化修飾的探針。首先,以目標miRNA分子為模板,通過T4 RNA連接酶2的特異連接反應(yīng)產(chǎn)生LCR的連接模板。然后,在熱穩(wěn)定DNA連接酶作用下,進行高效LCR反應(yīng),產(chǎn)生大量熒光標記的DNA產(chǎn)物。隨后,利用lambda核酸外切酶對雙鏈DNA中5?端磷酸化修飾DNA鏈的水解作用,使空白溶液和LCR反應(yīng)中未反應(yīng)的DNA探針降解為熒光標記的單核苷酸片段。而LCR產(chǎn)物中由于無5?端磷酸化修飾,不會被

4、 lambda核酸酶降解。當(dāng)加入陽離子共軛聚合物(CCP),其與DNA通過強靜電力結(jié)合,與DNA上的熒光分子發(fā)生高效熒光共振能量轉(zhuǎn)移,并實現(xiàn)熒光信號的二次放大。相比較,熒光標記的單核苷酸片段帶電荷少,與CCP靜電力作用弱,二者不能發(fā)生有效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移,基于此,實現(xiàn)了 miRNA的特異、高靈敏度分析。方法均相操作,簡便、靈敏度高,可實現(xiàn)0.1 fM目標miRNA分子的高靈敏度檢測和特異區(qū)分單堿基差別的miRNAs,并成功應(yīng)用于人肺組