DNA納米結(jié)構(gòu)的純化和基于氧化石墨烯的生物傳感器的研究.pdf

1、目的:
　　 利用超速離心機，根據(jù)密度梯度離心法分離純化DNA Origami/DNATetrahedron，期望通過該方法能夠?qū)NA Origami/DNA Tetrahedron中的單體和聚體很好分開。
　　 基于氧化石墨烯(GO)和奧曲肽(Octreotide)構(gòu)建的納米生物傳感平臺，進行簡單、快速、靈敏的檢測奧曲肽抗體和大鼠胰腺外分泌細胞，從而用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的早期檢測與診斷。
　　 方法:
　

2、　 1.DNA Origami的分離純化:以甘油為密度梯度介質(zhì)，根據(jù)密度梯度離心法中的速率區(qū)帶離心法分離純化，離心完畢，人工取樣分裝收集離心管中所得到的離心液，然后用0.7％的瓊脂糖凝膠電泳表征驗證離心分離的效果。
　　 2.DNA Tetrahedron的分離純化:分別以甘油和蔗糖為密度梯度介質(zhì)，根據(jù)密度梯度離心法之速率區(qū)帶分離純化DNA Tetrahedron，離心完畢，人工取樣分裝收集離心管中的所有離心樣品，然后用10％

3、的聚丙烯酰胺凝膠電泳表征驗證離心分離的效果。
　　 3.基于氧化石墨烯(GO)和奧曲肽(Octreotide)構(gòu)建的納米傳感平臺快速、靈敏地檢測奧曲肽抗體和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞:利用奧曲肽(Octreotide)能夠可以和奧曲肽抗體高選擇性，高親和性，特異性結(jié)合的特點，GO獨特的淬滅效應(yīng)以及GO，奧曲肽，奧曲肽抗體三者之間相互作用的差異，建立一種簡單快速的檢測奧曲肽抗體的方法。GO能夠吸附熒光標(biāo)記的奧曲肽并導(dǎo)致其熒光淬滅，從而得到

4、低熒光的復(fù)合物，而奧曲肽抗體可以和奧曲肽選擇性，特異性結(jié)合，從而使其遠離GO表面，熒光值得以恢復(fù)。另外，我們用大鼠胰腺外分泌細胞(AR42J)代替奧曲肽抗體，進一步研究該傳感器在臨床腫瘤檢測方面的應(yīng)用價值，該細胞是一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞，其細胞膜表面過量表達生長抑素受體-2，而奧曲肽可以和生長抑素受體-2高選擇性、高特異性、高親和性結(jié)合，同時用一種細胞膜表面不表達該受體的中國倉鼠卵巢細胞(CHO)做對照，基于上述同樣的原理，我們建立了一

5、種簡單、快速、靈敏地檢測神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞的方法。
　　 結(jié)果:
　　 1.DNA Origami的分離純化:我們共分離純化了兩種構(gòu)型的DNA Origami方塊，對于方塊1而言，從0.7％的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn):單鏈，單體，聚體能夠很好地分開;而對于方塊2，用0.7％的瓊脂糖凝膠電泳圖上，其單體和聚體都是成彌散狀分布沒有分開.不管改變什么離心參數(shù)之后，其單體和聚體始終黏在一起，整體遷移沒有分離效果。
　　 2

6、.DNA Tetrahedron的分離純化:從10％聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNA Tetrahedron的單體和聚體始終黏在一起分布于離心管的上部，沒有分開，也沒有分離的趨勢。
　　 3.基于氧化石墨烯(GO)和奧曲肽(Octreotide)構(gòu)建的納米傳感平臺快速、靈敏地檢測奧曲肽抗體和檢測神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細胞:GO，奧曲肽以及奧曲肽抗體之間相互作用的差異，GO能夠吸附熒光標(biāo)記的奧曲肽的熒光并使其熒光淬滅從而得到低熒光的復(fù)合

7、物，當(dāng)加入奧曲肽抗體后，熒光值恢復(fù)，用該方法可以檢測到低至2 ng/mL的奧曲肽抗體，靈敏度高、選擇性強、重現(xiàn)性好。與此同時我們用大鼠胰腺外分泌細胞(AR42J)代替奧曲肽抗體，用Zeiss熒光顯微鏡成像觀察AR42J細胞膜表面很強的熒光，而CHO細胞膜表面雖然也有部分熒光現(xiàn)象，但其熒光強度明顯弱于AR42J細胞。推測可能是因非特異性吸附引起的。當(dāng)加入GO之后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR42J細胞依然表現(xiàn)很強的熒光，但其熒光強度較弱于未加GO組，而

8、CHO細胞因為細胞膜表面不表達生長抑素受體-2，沒有與奧曲肽特異性結(jié)合物質(zhì)，在實驗洗滌過程中被洗掉，其熒光顯著降低，幾乎沒有熒光信號，證明了該方法的特異性。
　　 結(jié)論:
　　 本論文成功地將具有沉降系數(shù)差異的DNA Origami的中的單體和聚體很好的分開，為DNA Origami的進一步研究應(yīng)用奠定了很好的基礎(chǔ);另外，成功構(gòu)建了基于氧化石墨烯和奧曲肽的納米生物傳感平臺，能夠簡單、快速、靈敏地檢測奧曲肽抗體和大鼠胰腺外