構建白血病免疫學分型細胞芯片的片基選擇及最佳修飾方法的研究.pdf

1、目的： 隨著大量抗白細胞表面分化抗原單克隆抗體的問世，應用其來檢測白血病細胞表面分化抗原，以確定其細胞系列來源及發(fā)育階段，推動了白血病免疫學分型的研究，提高了白血病診斷的準確性。目前常用的進行白血病免疫學分型的方法有免疫組化法、免疫熒光法，但這兩種方法存在很多缺陷。前者不能同時進行多種抗原檢測；檢測一種抗原需要的單克隆抗體量較多，不經(jīng)濟；處理步驟多，費時。后者同時檢測抗原種類有限；檢測所需的熒光顯微鏡或流式細胞儀設備昂貴。對細胞

2、高通量研究的要求與芯片技術的結合使細胞芯片應運而生，這種新型的檢測技術平臺的出現(xiàn)，克服了上述方法的缺陷，使白血病的免疫學分型高通量診斷更快捷、方便。 本實驗室構建的用于白血病免疫學分型的細胞芯片就是利用抗原、抗體特異性結合的原理，將白細胞表面分化抗原單克隆抗體固定于載體上，形成抗體點陣。不同的單克隆抗體能夠自動識別和捕獲表達相應表面分化抗原的細胞，從而對白血病進行免疫學分型。 載體選擇是芯片制備過程中的第一個關鍵步驟。選

3、擇何種載體及如何修飾才能使單克隆抗體更牢固、更特異性地固定在載體表面，同時使固相支持物表面的蛋白保持最大的活性，是影響該技術檢測成功率的關鍵。本實驗欲探索制備細胞芯片的最佳載體及載體的最佳修飾方法。 方法： 1、制備5種片基分別對玻片進行氨基硅烷-醛基修飾、殼聚糖-氨基修飾、殼聚糖.醛基修飾、巰基修飾；聚苯乙烯板蒸餾水超聲清洗備用。 2、確定5種片基的最佳點樣緩沖液pH值分別用含3％甘油的pH值為6.0、7.2、

4、8.5的磷酸鹽緩沖液和pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液，1∶4稀釋CD單抗，在5種片基上點制抗體點陣，水化、封閉、清洗。取新鮮正常人的外周血2ml，用本實驗室自配的全白細胞分離液提取白細胞(>1×10<'6>/ml)，丫叮橙染色、清洗，孵育芯片45分鐘，PBS清洗至背景干凈，掃描，分析不同片基的最佳點樣緩沖液pH值。 3、確定5種片基固定抗體的飽和濃度將原濃度是200μg/ml的CD單抗分別按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶3

5、2、1∶64稀釋后，在5種片基上按濃度下降的次序點樣， FITC標記的羊抗鼠IgG溶液(濃度100μg/ml)孵育30分鐘，分析不同片基固定抗體的飽和濃度。 4、確定5種片基固定抗體的最佳時間在5種片基上固定CD單抗，分別在濕盒中4℃水化0.5、1、2、4、12、24、48小時，F(xiàn)ITC標記IgG溶液孵育，分析不同片基固定抗體的最佳時間。 5、檢測5種片基的蛋白結合力在5種片基上固定FITC標記的熒光抗體，比較不同片基的

6、平均熒光信號強度及不同部位熒光信號強度的變異率。 6、檢測5種片基固定的蛋白活性及保存時間對蛋白活性的影響在芯片制備后1天、1個月、3個月和6個月，分別用熒光標記抗體和熒光標記細胞來檢測蛋白的活性。 結論： 氨基硅烷-醛基玻片在以pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液作為點樣緩沖液，固定蛋白的濃度為50μg/ml，固定時間大于12小時的條件下，對蛋白的固定效率及固定蛋白的反應性最好，且明顯優(yōu)于其他片基，可做為制備白血病免疫