過山楓提取物抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有效部位篩選及藥理藥效學(xué)研究.pdf

1、1.目的與意義
　　 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種因?yàn)椴幻鞯?、慢性進(jìn)行性的系統(tǒng)性炎癥性疾病。其特點(diǎn)為滑膜增生和外周關(guān)節(jié)對稱性、侵蝕性關(guān)節(jié)炎,但也可以導(dǎo)致全身系統(tǒng)性表現(xiàn)。RA為常見多發(fā)病,國外患病率為0.5％～3％,國內(nèi)0.3％～0.5％,好發(fā)年齡20～45歲,男女發(fā)病率比率約為1:3。一般情況下,RA患者都會有持續(xù)的滑膜炎、進(jìn)行性的關(guān)節(jié)破壞和功能障礙而致殘障,長期的病程及最后關(guān)節(jié)損傷所致的

2、功能障礙給患者及家庭造成極大的痛苦和負(fù)擔(dān)。
　　 目前認(rèn)為RA的病兇與遺傳、感染、隨機(jī)和性激素等因素相關(guān)。RA的發(fā)病機(jī)制尚未有確切定論,在RA病程中貫穿了滑膜組織增生、炎癥、骨及軟骨降解和破壞、關(guān)節(jié)的進(jìn)行性破壞、自身免疫等病理生理過程,而且它們之間相互作用、相互關(guān)聯(lián),形成一個錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。80年代有人提出RA是T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,CD4T細(xì)胞尤其在RA慢性炎癥的啟動及持續(xù)過程中起主要作用,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulato

3、ry T cells,Treg)更是近年對RA的發(fā)生發(fā)展及機(jī)制方面的研究熱點(diǎn)。同時越來越多證據(jù)顯示關(guān)節(jié)滑膜成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA synovialfibroblasts,RA-SF)對RA發(fā)病和遷延具有重要的影響,參與關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞；RA-SF具有轉(zhuǎn)化特征,且發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變,在RA進(jìn)展中,RA-SF既是被動反應(yīng)又是主動參與；有研究認(rèn)為RA-SF的大量增殖與細(xì)胞周期(增殖、凋亡)失調(diào)有關(guān)。
　　 臨床上,用于RA治療的常用藥物

4、主要包括非類固醇抗炎藥(nonsteroidalanti-inflamnlatory drugs,NSAID)、緩解疾病的抗風(fēng)濕性藥物(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARD)、激素、針對不同靶向的生物制劑。盡早應(yīng)用DMARD已成為醫(yī)學(xué)界的共識,甲氨蝶呤、羥氯喹、來氟米特等均是常用藥物；而外周血干細(xì)胞移植和基因治療都是RA治療的發(fā)展方向。傳統(tǒng)抗RA藥的毒副作用較大,而新興的生物治療、基因

5、治療價格昂貴,患者長期服用依從性差,不利于疾病控制。因此研制開發(fā)有效、毒副作用小的抗RA藥物勢在必行。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)的疑難雜癥,在長期的中醫(yī)臨床實(shí)踐中,中藥臨床治療效果顯著,因此,對臨床治療有效的中藥單味藥及復(fù)方的開發(fā)具有重要的意義。
　　 過山楓[Celastrus aculeatus Merr]屬衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物,具有祛風(fēng)除濕、行氣活血、消腫解毒等功效,中國民間常用該藥的水煎劑或外敷來治療風(fēng)濕痹癥,臨床上常用于治療RA

6、并取得良效。研究發(fā)現(xiàn)過山楓中主要成分有萜類、黃酮類、醇類等。有研究證實(shí):過山楓乙醇提取物對Ⅱ膠原誘發(fā)的RA炎癥有顯著抑制作用；過山楓乙醇提取物可抑制淋巴細(xì)胞增生,同時能使淋巴細(xì)胞移動減慢、誘導(dǎo)人T淋巴細(xì)胞株CEM-6T細(xì)胞凋亡；過山楓乙醇提取物可以顯著抑制關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)MMP-3、TMIP-1和MMP-3/TMIP-1的表達(dá),提示過山楓乙醇提取物抗炎、調(diào)節(jié)免疫作用與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶作用相關(guān)。本課題組前期研究結(jié)果證明過山楓乙醇提取物對炎癥動

7、物模型具有顯著抗炎鎮(zhèn)痛作用,對熱殺死結(jié)核分支桿菌H37Ra(Mycobacterium tuberculosis H37Ra,Mtb)誘導(dǎo)的佐劑性關(guān)節(jié)炎模型(adjuvant-induced arthritis,AA)的關(guān)節(jié)炎癥及病情進(jìn)展有顯著抑制作用。
　　 在醫(yī)學(xué)與藥物的研究中,實(shí)驗(yàn)動物模型的建立是非常重要的。目前在RA研究中常用的實(shí)驗(yàn)動物模型有:Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎(collagen Ⅱ-inducedarthritis,CI

8、A)、AA模型。AA模型癥狀直觀,且炎癥是T細(xì)胞依賴性,因此常用于關(guān)節(jié)炎新藥篩選和RA自身免疫機(jī)制的研究。本課題組前期研究建立了以Mtb誘導(dǎo)SD大鼠從模型,與臨床RA表現(xiàn)癥狀有較大的相似性,其病情表現(xiàn)及進(jìn)程與臨床類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相近,同時該模型制作方法簡單,成模率高,經(jīng)濟(jì)實(shí)用。
　　 過山楓的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用可能是其治療RA的重要基礎(chǔ),但是關(guān)于過山楓抗RA的藥理作用研究和化學(xué)成分研究目前國內(nèi)外報道并不多見。基于上述研究背景,本論文

9、主要工作是采用體外T淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)篩選過山楓效應(yīng)成分,并觀察對細(xì)胞凋亡的影響；通過建立合理有效的大鼠RA模型,觀察效應(yīng)成分對RA動物模型抗炎作用及相關(guān)藥理機(jī)制；全面評價過山楓治療RA的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制,為臨床上開發(fā)治療RA的中藥新藥提供科學(xué)依據(jù)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 2.1過山楓提取物有效部位的體外篩選及誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
　　 采用化學(xué)提取法對過山楓乙醇提取物進(jìn)行分離,以體外培養(yǎng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及

10、MTT比色法對乙醇提取物乙酸乙酯(GSF-A)、三氯甲烷(GSF-B)、石油醚部位(GSF-C)進(jìn)行活性篩選；采用柱層析分離技術(shù),對篩選的活性部位再進(jìn)一步分離,得到GSFY-A、GSFY-B、GSFY-C部位。通過體外培養(yǎng)ConA誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn),采用T淋巴細(xì)胞Annexin V-PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞凋亡率。
　　 2.2 Mtb誘導(dǎo)SD大鼠AA模型建立
　　 采用熱殺死結(jié)核桿菌(Mycobacter

11、ium tuberculosis H37Ra,Mtb),誘導(dǎo)SD大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎,并對模型進(jìn)行客觀評價。SPF級雄性SD大鼠24只,隨機(jī)分為兩組,對照組、模型組,模型組大鼠尾根部一次性皮下注射Mtb-礦物油誘導(dǎo)劑,定期記錄兩組大鼠的一般體征、體重、足容積、關(guān)節(jié)炎癥、外周血液常規(guī)、血液流變學(xué)、外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)滑膜病理等指標(biāo),評價Mtb誘導(dǎo)SD大鼠AA模型的特點(diǎn),綜合評價該模型的合理性、有效性。
　　 2.

12、3過山楓乙酸乙酯部位對從模型大鼠的抑制作用及相關(guān)機(jī)制研究
　　 SPF級雄性SD大鼠60只,隨機(jī)分為五組,空白組、模型組、MTX組、過山楓低劑量組、過山楓高劑量組,除空白組以外,其余各組大鼠均在尾根部一次性皮下注射Mtb-礦物油誘導(dǎo)劑,定期記錄五組大鼠的一般體征、體重、足容積、關(guān)節(jié)炎癥、外周血液常規(guī)、血液流變學(xué)、外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)滑膜病理等指標(biāo)改變,觀察過山楓對Mtb誘導(dǎo)SD大鼠從模型的抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用

13、。
　　 3.結(jié)論
　　 過山楓不同極性部位對小鼠淋巴細(xì)胞增殖有抑制作用,其中乙酸乙酯部位及乙酸乙酯柱層析分離物對T淋巴細(xì)胞增殖有顯著抑制作用,同時乙酸乙酯部位及其柱層析分離物均對T淋巴細(xì)胞凋亡有誘導(dǎo)作用；提示過山楓誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用是其抑制T淋巴細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。
　　 Mtb誘導(dǎo)SD大鼠的佐劑性關(guān)節(jié)炎模型:該模型材料容易獲得,對SD大鼠有較高敏感性,制作方法簡單,可重復(fù)性強(qiáng),成功率高；關(guān)節(jié)炎癥及臨床表現(xiàn)持續(xù)