樟芝深層液體發(fā)酵工藝及其多糖特性的研究.pdf

1、樟芝(Antrodia camphorata)是新近發(fā)現(xiàn)的一種食藥用真菌,因為其子實體具有的生物活性作用,引起廣泛的關注；出于對保護環(huán)境、自然資源匱乏和子實體栽培技術尚未成功等因素的考慮,近年來,樟芝菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)的研究進展迅速。多糖是樟芝中主要的生物活性因子,對樟芝深層發(fā)酵營養(yǎng)保健產品研究和開發(fā)有著重要的意義。本文研究內容包括樟芝深層發(fā)酵生物學特性、樟芝多糖和菌絲體產量為指標的最佳培養(yǎng)基配方的篩選、樟芝發(fā)酵工藝、樟芝菌絲體多糖提取

2、工藝、樟芝深層發(fā)酵菌絲體營養(yǎng)成分分析,以及樟芝菌絲體多糖的理化特性、功能學特性等品質學性質的研究,并在此基礎上開發(fā)出樟芝菌絲體多糖口服液。主要研究結果如下：
　　 ⑴樟芝菌株鑒定rDNA序列分析。樟芝菌株rDNA的ITS序列在NCBI上BLAST,進行同源性比對達99％以上,可判斷所用菌株確實為樟芝菌株Antrodia camphorata。
　　 ⑵樟芝菌絲體深層發(fā)酵生物學特性的研究。十五種碳源對比實驗結果表明：采用天

3、然多糖類物質(米粉、面粉、玉米粉、甘薯粉、木薯粉)為培養(yǎng)基碳源,其樟芝菌絲體產量,明顯高于雙糖和單糖(麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖),也高于化學制劑多糖(可溶性淀粉、微晶纖維素)。三類氮源,對樟芝菌絲體產量的影響結果顯示:有機氮高于銨態(tài)氮,銨態(tài)氮高于硝態(tài)氮。即有機氮(黃豆粉>玉米粉>蛋白胨)>銨態(tài)氮(酒石酸銨>氯化銨>磷酸氫二銨>硫酸銨)>硝態(tài)氮,樟芝不能利用硝態(tài)氮。樟芝菌絲生長最適合的碳氮比(C／N)為5

4、0:1～100:1；常量元素鈉離子和鎂離子對樟芝菌絲生長并不是必需的；鈣、硫、磷、鉀離子是樟芝菌絲生長所必需的,缺乏鉀離子將顯著地影響菌絲生長。微量元素Co對菌絲生長有抑制作用；分別添加6種維生素(生物素、核黃素、硫胺素、尼克酸、葉酸、抗壞血酸)對樟芝菌絲生長沒有顯著影響；樟芝菌絲適于酸性和中性條件下生長,pH4～8之間菌絲生長速度差異不顯著,都生長較好；pH9以上菌絲不能生長；光照與黑暗下樟芝菌絲的生長沒有顯著差異。
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5、樟芝菌絲體深層發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵動力學的研究。以樟芝菌絲體含量和樟芝多糖含量作為指標,采用L27(313)五因素三水平的正交設計,確定樟芝菌的深層發(fā)酵最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯20％+(黃豆粉O.5％+玉米粉O.5％)+(酵母膏0.15％+蛋白胨0.15％)+麩皮0.2％+(KH2PO40.05％+MgSO40.035％)。以樟芝菌絲體含量和樟芝多糖含量作為指標,采用U12(1212)三因素四水平的均勻設計,確定最佳的發(fā)酵參數:接

6、種量為15％(V／V),種子菌齡為8d,培養(yǎng)溫度為26℃。同時獲得樟芝菌絲體干重為11克／升發(fā)酵液。通過發(fā)酵動力學的研究,掌握了樟芝發(fā)酵過程各項指標的變化規(guī)律:發(fā)酵4天以后,菌絲開始快速生長,氨態(tài)氮水平降低。在發(fā)酵后的第16天,菌絲生長到達了穩(wěn)定期,之后有些老菌絲開始自溶,使氨態(tài)氮又有所回升。這一轉折點作為菌絲對數生長轉入穩(wěn)定期的標志。
　　 ⑷樟芝多糖提取工藝研究。樟芝菌絲體中粗脂肪含量為11.61％(m／m),其中飽和脂肪酸

7、占12.6％(v／v),不飽和脂肪酸占87.4％(v／v)；樟芝菌絲體中粗蛋白含量為34.20％(m／m),總氨基酸含量為270.68mg／kg(m／m),達FAO標準的26.6倍,含有人體所需的8種必需氨基酸；樟芝菌絲體含常量元素K、Na、P、Ca、Mg和多種人體所需的微量元素Fe、Zn、Mn、Cu、Mo、Cr、Se、sr等；樟芝菌絲體中麥角甾醇的含量為19.55mg／g(m／m),總三萜的含量為2.81mg／g(m／m)。樟芝菌絲浸

8、提的次數為2次時,可提取其中多糖的94％；利用超低溫冷凍方法處理(凍融破壁作用)對樟芝多糖的提取具有很好的效果,其它方法處理的效果(超聲波處理、液氮處理、冷凍干燥處理等)都比對照菌絲干燥法有不同程度的提高。利用響應面法優(yōu)化樟芝多糖提取工藝和條件。建立了樟芝多糖提取方法的二次多項數學模型,驗證了模型的有效性,并探討了溫度、時間、水料比三個因子的交互作用及其最佳水平范圍,優(yōu)化出樟芝多糖提取的外界條件為:溫度120℃,時間110.4min,水

9、料比1:1.89。
　　 ⑸樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖性質的研究。對樟芝菌絲體提取液、樟芝發(fā)酵液在不同乙醇濃度下沉淀得到的多糖的理化性質、紅外光譜和凝膠色譜特征等進行研究,結果顯示:樟芝菌絲體多糖為棕褐色蓬松粉末,質輕,無特殊氣味,易溶于水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑,其比旋光度為48.31；樟芝菌絲體多糖與苯酚-硫酸試劑反應呈紅色,與蒽酮試劑反應呈藍綠色,與間苯二酚試劑反應呈紫紅色,與KI-I2不顯色。紅外光譜測定表明,不同

10、乙醇濃度梯度沉淀的樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖具有多糖的特征吸收,并且其糖環(huán)為吡喃環(huán)。分步沉淀的樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖經高效液相色譜GPC柱分離各得到3～4個峰,計算得各組分的數均分子量和重均分子量。不同濃度乙醇沉淀處理對樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖分子量的影響表現(xiàn)在低濃度(65％)乙醇沉淀出較大分子量的多糖組分,而高濃度(75％、85％)乙醇沉淀出較小分子量的多糖組分。較高濃度乙醇沉淀的多糖,不管是樟芝發(fā)酵液多糖還是樟芝菌絲體多糖,體外試驗表明都

11、具有較高的清除超氧自由基的活性。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2的多糖含量分別為31.76％和38.09％,樟芝菌絲體多糖、發(fā)酵液多糖的提取率分別為1.59％和4.89％。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2的特性粘度[η]為1.982和1.657。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2經高效液相色譜GPC柱分離后,各得到三個峰,高效液相色譜測定證明樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖中已完全除去蛋白質和小分子還原糖,

12、因此,凝膠色譜圖之間的色譜峰為大分子多糖。采用GPC軟件計算樣品各組分的數均分子量和重均分子量。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2為灰白色疏松纖維狀粉末,紅外光譜圖及譜峰歸屬分析得出兩種多糖樣品均具有多個多糖特征吸收峰。樟芝菌絲體多糖ACP1和樟芝發(fā)酵液多糖ACP2的濃度達3g／L時,超氧自由基的清除率分別達到74.8％和76.9％。ACP1和ACP2經凝膠葡聚糖sephadexG-200柱層析分別洗脫出的精多糖單一主峰AC

13、P1-1和ACP2-1,其超氧自由基的清除率分別達到54.7％和61.6％,說明樟芝菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖具有較強的體外抗氧化能力。
　　 ⑹樟芝菌絲體、發(fā)酵液多糖生物活性的研究。樟芝菌絲體多糖和發(fā)酵液多糖對小鼠宮頸癌U14有顯著抑制作用,其腫瘤抑制率分別為44.7％和77.2％,樟芝發(fā)酵液多糖的抑制率顯著高于樟芝菌絲體多糖的抑制率。選擇樟芝菌絲體多糖(胞內ACP1)和樟芝發(fā)酵液多糖(胞外ACP2)的低、中、高劑量組,分別為10

14、0、400、1600mg／kgBW三個劑量,連續(xù)灌胃30天,進行小鼠免疫功能試驗。試驗結果說明樟芝菌絲體多糖和樟芝發(fā)酵液多糖(ACP1、ACP2)對小鼠的細胞免疫、體液免疫、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面均有增強作用,且有劑量效應關系；樟芝發(fā)酵液多糖這四個方面的免疫功能都高于樟芝菌絲體多糖。
　　 ⑺樟芝多糖口服液的研制。以感官評價分數作為評定指標,采用正交實驗設計,優(yōu)化樟芝發(fā)酵多糖口服液的制備工藝?？诜褐刑砑踊旌咸?/p>