zVAD-fmk對(duì)imDC誘導(dǎo)初始性CD4+T細(xì)胞分化為Treg影響的體外研究.pdf

1、目的:
　　從人外周血中獲得imDC,并與另一個(gè)體臍血來源的初始性CD4+T細(xì)胞混合培養(yǎng),運(yùn)用特異性阻斷劑zVAD-fmk阻斷Caspase信號(hào)傳導(dǎo)通路,研究Caspase通路在imDC誘導(dǎo)同種異體T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg細(xì)胞中的作用,探討免疫耐受可能的分子機(jī)制。
　　方法:
　　取健康成年人外周靜脈血50ml,用密度梯度離心法分離PBMC,將分離的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)2h后加入GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)、擴(kuò)增7天,使其轉(zhuǎn)化為i

2、mDC。另取其他健康胎兒臍血10ml,密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞,用免疫磁珠分選法從單個(gè)核細(xì)胞中分離CD4+T細(xì)胞,均分為5組細(xì)胞:
　　(1)空白組:初始性CD4+T細(xì)胞加入等容量RPMI-1640單獨(dú)培養(yǎng);
　　(2)混合對(duì)照組:imDC與初始性CD4+T細(xì)胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng),不加其他試劑,誘導(dǎo)Treg;
　　(3)低濃度zVAD-fmk組:imDC與初始性CD4+T細(xì)胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng)

3、同時(shí)加入終濃度為10μmol/L的zVAD-fmk;
　　(4)中濃度zVAD-fmk組:imDC與初始性 CD4+T細(xì)胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng)同時(shí)加入終濃度為20μmol/L的zVAD-fmk;
　　(5)高濃度zVAD-fmk組:imDC與初始性CD4+T細(xì)胞以1:10的濃度比例混合培養(yǎng)同時(shí)加入終濃度為30μmol/L的zVAD-fmk。再進(jìn)行混合培養(yǎng)5天,以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)轉(zhuǎn)

4、化率。
　　結(jié)果:
　　(1)、imDC的鑒定:形態(tài)學(xué)方面:培養(yǎng)至第七天的PBMC懸浮生長(zhǎng),表面可見毛刺狀突起,體積較前增大,鏡下觀察:成簇的細(xì)胞團(tuán)散開,形態(tài)不規(guī)則的貼壁細(xì)胞減少。經(jīng)誘導(dǎo)后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子。
　　(2)、混合培養(yǎng)后以FCM檢測(cè)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率,T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率結(jié)果為:空白組:1.78±0.11、混合對(duì)照組:22.23±0.77、低濃度zVAD-fmk組:21.63±0

5、.82、中濃度zVAD-fmk組:12.24±0.54、高濃度zVAD-fmk組:12.20±0.96、,除混合對(duì)照組和低濃度組、中濃度組和高濃度組之間外,各組間 P值<0.05,差異有顯著性。結(jié)果說明:加入zVAD-fmk并與imDC細(xì)胞混合培養(yǎng)的T細(xì)胞轉(zhuǎn)化率相對(duì)于未加入阻斷劑的T細(xì)胞較低,同時(shí)Caspase信號(hào)通路對(duì)zVAD-fmk無濃度依賴性。
　　結(jié)論:
　　(1)、通過應(yīng)用rhGM-CSF+rhIL-4聯(lián)合誘導(dǎo)PB