BM MSCs免疫抑制及HO-1-MSCs對大鼠受損腸道修復作用的研究.pdf

1、目的:1、探討大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs)對淋巴細胞增殖的作用。
　　 2、探討B(tài)MMSCs及轉(zhuǎn)染HO-1后的BMMSCs（HO-1/MSCs）移植對腸道缺血再灌注損傷（ischemiaandreperfusioninjury，IRI）的保護作用。
　　 方法:1、體外實驗:分離和鑒定大鼠BMMSCs，與淋巴細胞、刀豆蛋白(Concanavalin，C

2、onA)建立共培養(yǎng)體系，混合培養(yǎng)0h、24h和48h后，用ELISA方法檢測上清中TNF-α、TGF-β1和IL-10的分泌量，MTT方法檢測淋巴細胞數(shù)目變化，流式細胞儀檢測調(diào)節(jié)T細胞(RegulatoryTcells，Treg)的含量變化。
　　 2、體內(nèi)實驗:(1)取同齡健康雄性Wistar大鼠骨髓，進行體外提取、培養(yǎng)BMMSCs，將采用密度梯度離心法傳代培養(yǎng)的第3代細胞進行表型鑒定并制備懸液備用。(2)在健康Wistar大

3、鼠腸黏膜下注射皮膚黑色素瘤細胞，并用底物熒光素法示蹤細胞。(3)建立同齡健康雄性Wistar大鼠的腸道缺血-再灌注模型，分為實驗組（1mlHO-1/MSCs或1mlBMMSCs經(jīng)腸黏膜下植入）和對照組（等量生理鹽水經(jīng)腸黏膜下注射）。(4)標本制備:于術(shù)后不同時間(0、2、6、24、72、120h)留取血清，采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)、光鏡、透射電鏡、蛋白印跡雜交(Westernblot)、免疫組織化學等方法進行檢測。
　　 結(jié)

4、果:1、體外實驗:BMMSCs可使TNF-α分泌量降低，TGF-β1和IL-10分泌量升高，細胞增殖實驗顯示OD值明顯低于未加BMMSCs組的對照組(P＜0.05)，流式細胞儀檢測顯示BMMSCs可使Treg含量升高。
　　 2、體內(nèi)實驗:(1)體外成功分離、擴增、純化BMMSCs，原代細胞消化傳代后雜質(zhì)細胞減少，細胞純度提高。培養(yǎng)的第三代貼壁細胞大部分表達CD29、CD90及RT1A，表達率分別達97.12％、97.07％及9

5、8.07％，而不表達CD34、CD45及RT1B。(2)注射B16-F10-Luc-G5細胞2h后，細胞定植在腸道，獲取大鼠腸道，大量PBS反復沖洗，仍然可見細胞明顯定植，并可以長期存活。(3)夾閉腸系膜前動脈后，動脈搏動消失，腸管變白、痙攣、皺縮、蠕動喪失，恢復動脈搏動后，腸管顏色逐漸變紅。(4)形態(tài)學方面:實驗組小腸組織HE染色顯示:小腸絨毛水腫、腸上皮細胞壞死、腸道間質(zhì)充血及炎癥細胞浸潤程度與對照組相比明顯減輕，并且HO-1/MS

6、Cs組較BMMSCs組效果更為顯著;電鏡下顯示:實驗組小腸絨毛破壞程度減輕，腸道緊密連接完整，細胞器恢復正常形態(tài)，HO-1/MSCs組效果更為顯著。(5)血清ELISA結(jié)果:實驗組血清中二胺氧化酶（Diamineoxidase，DAO）、D-乳酸和TNF-α含量均較對照組減少，以HO-1/MSCs更為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義。(6)免疫組化及Westernblot結(jié)果均顯示Occludin蛋白的表達在實驗組明顯高于對照組，尤其是HO-1

7、/MSCs組，這提示單純BMMSCs組能夠促進Occludin蛋白的生成，并且HO-1/MSCs組能夠發(fā)揮HO-1與BMMSCs的協(xié)同作用，對Occludin蛋白的表達共同起到促進作用。
　　 結(jié)論:1、體外實驗:(1)用密度梯度離心聯(lián)合貼壁法可分離、純化大鼠BMMSCs，方法簡單，費用低廉，易應用;且BMMSCs在體外可以大量擴增，傳代培養(yǎng)的細胞純度較高，為后續(xù)實驗提供了充足的細胞來源。(2)BMMSCs在單獨存在時對淋巴細胞

8、的增殖具有抑制作用，并且作用程度隨時間變化不明顯，其中IL-10、TGF-β1以及Treg細胞參與了這種免疫抑制過程。
　　 2、體內(nèi)實驗:(1)夾閉大鼠腸系膜前動脈可以造成大鼠腸道黏膜的潰瘍、出血和壞死，模型穩(wěn)定，適合作為研究對象。(2)在缺血再灌注損傷的大鼠腸黏膜下移植HO-1/MSCs或BMMSCs可以修復受損腸道功能、小腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)、小腸上皮細胞間緊密連接和提高緊密連接蛋白(Occludin)的表達水平，從而阻止腸道缺