OX40-OX40L–NFAT信號通路與川崎病免疫損害機制的相關性研究.pdf

1、本論文包括三個部分:
　　第一部分：系統(tǒng)生物學方法整合分析川崎病相關基因及NFAT信號通路的構建
　　目的:以系統(tǒng)生物學方法整合分析川崎病(Kawasaki disease, KD)相關基因,并構建可能的生物信息通路,進一步探討KD免疫損害的發(fā)生機制。
　　方法:以‖Kawasaki disease‖―Kawasaki syndrome‖―lymph node syndrome‖―mucocutaneous lymph

2、 node syndrome‖和―polymorphism‖―gene‖―genetic‖―allele‖―genotype‖等為相關檢索語言,在Pubmed、Ovid、Google Scholar數據庫中檢索與KD相關基因的文獻,提取有統(tǒng)計學意義的基因。用DAVID軟件在基因功能、信息通路等方面對基因進行功能注釋;用GeneGo MetaCore進行富集分析并構建生物信息通路;用STRING分析這些基因編碼的蛋白之間聯(lián)系。
　　

3、結果:與川崎病有統(tǒng)計學意義的基因主要涉及KD易感性、冠脈損害、不完全KD、IVIG治療無反應、KD延遲診斷等,其中候選基因組65個,全基因組關聯(lián)分析18個。DAVID軟件分析顯示這些基因的功能主要集中于損傷與防御反應、炎癥反應(富集分數=15.91);細胞鈣離子平衡穩(wěn)態(tài)、細胞趨化(富集分數=3.75),免疫系統(tǒng)的調節(jié)(富集分數=3.58)。GO Process顯示基因的功能主要富集于免疫反應、損傷與防御反應、應激反應等,與DAVID顯示

4、的基因功能注釋相符。GO Disease顯示,這些基因參與了皮膚黏膜淋巴結綜合征(即KD)、炎癥性腸病、皮膚疾病、血管炎性疾病、關節(jié)炎等免疫炎癥性疾病的病理生理過程。GO Pathway顯示,這些基因富集的通路主要集中于免疫反應信號通路,如:HSP60和HSP70/TLF信號通路、炎性反應信號通路、纖維蛋白溶酶信號通路、細胞核活化因子NFAT與白細胞相互作用的信號通路、樹突狀細胞中組胺信號通路等。除免疫反應信號通路外,同時還有粘附分子信

5、號通路、生長與繁殖信號通路、凋亡與存活信號通路等。STRING顯示與KD相關的基因編碼的蛋白間密切相連,并構成相互交錯的信息網絡,其中TNF-α處于網絡的中心環(huán)節(jié)。
　　結論:
　　1.KD有統(tǒng)計學意義的基因間密切關聯(lián),形成眾多免疫、細胞粘附、增殖、凋亡與存活等信號通路,共同參與了KD的免疫損傷過程。
　　2.NFAT信號通路在KD的免疫損害過程中發(fā)揮了重要的作用。
　　第二部分:川崎病患兒外周血單個核細胞中OX

6、40、OX40L和NFAT的表達及OX40-OX40L對NFAT調控作用
　　目的:分析 OX40、OX40L及 NFAT在KD急性期的表達及其臨床意義,并探討OX40-OX40L與NFAT間的調控關系。
　　方法:1.選擇55例KD患兒,其中冠狀動脈損傷者12例,非冠狀動脈損害者43例。發(fā)熱及正常對照組各23例。采用Real-time PCR檢測OX40、OX40L及NFAT1、NFAT2 mRNA的表達,采用wester

7、n blot檢測OX40、OX40L及NFAT1、NFAT2蛋白的表達水平。2.培養(yǎng)正常兒童及 KD患兒 PBMC,分別以刺激型 OX40抗體及抑制型OX40L抗體作用于 OX40-OX40L軸后,Real-time PCR和 western blot檢測細胞中NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白的表達。
　　結果:
　　1. KD組急性期治療前PBMC中NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達水平顯著高于對照組(P<0

8、.01);KD冠脈損傷組NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達高于KD無冠脈損害組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.01)。KD治療后NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達明顯減少(P<0.01)。
　　2. KD組急性期治療前PBMC中OX40、OX40L mRNA及蛋白表達顯著高于對照組(P<0.01);KD冠脈損傷組OX40、OX40L mRNA及蛋白表達高于KD無冠脈損害組,但無統(tǒng)計學意義(P>0.01)。治療后OX40、

9、OX40LmRNA及蛋白表達明顯下降(P<0.01)。
　　3. KD組急性期PBMC中OX40、OX40L與NFAT1、NFAT2蛋白表達呈正相關(P<0.01)。
　　4.40 ug/ml anti-OX40單克隆抗體刺激正常兒童 PBMC48h,其 NFAT1、NFAT2 mRNA及蛋白表達顯著高于非刺激組(p<0.01)。20 ug/m1 anti-OX40L單克隆抗體作用于KD PBMC24h,其NFAT1、NFA