小膠質(zhì)細胞表達OX40L 對T細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、 小膠質(zhì)細胞是CNS中最主要的免疫活性細胞，已有研究證實，小膠質(zhì)細胞活化后是CNS內(nèi)最重要的APC,組成性低表達MHCⅡ，活化后誘導性高表達MHCⅡ以及CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD40、ICAM-1等多種免疫共刺激分子和粘附分子。體內(nèi)實驗也證明活化后小膠質(zhì)細胞具有抗原處理、提呈功能，可再次活化T淋巴細胞。因此，小膠質(zhì)細胞是最有可能參與CNS內(nèi)T細胞活化后效應功能維持的細胞，這一過程中涉及到的CNS內(nèi)的細胞和T淋

2、巴細胞直接作用的分子機制現(xiàn)在并不確切。 T細胞活化及效應維持不僅需要TCR與MHC-抗原肽復合物的作用，而且需要APC表達共刺激分子提供輔助信號。缺乏共刺激信號時，識別抗原后的T細胞會失能或死亡。在初始T細胞的活化階段，最早被深入研究的CD28、CD40L共刺激信號發(fā)揮重要作用，而在效應和記憶T細胞的功能發(fā)揮和維持階段大部分CD4+和CD8+T細胞并不依賴這兩條共刺激信號通路，還存在其它多種免疫分子參與調(diào)節(jié)活化后T細胞功能。其中

3、，共刺激分子對OX40-OX40L主要作用在效應T細胞的晚期應答階段。OX40在T細胞活化后期表達，相類似地，其配體OX40L也在樹突狀細胞(dendriticcell，DC)、B淋巴細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等APC活化后誘導表達，對促進T細胞的存活、增殖、細胞因子的釋放和記憶性T細胞的產(chǎn)生起著關(guān)鍵作用。OX40缺陷的T細胞在TCR作用后早期無明顯異常，但在T細胞活化后5-6天出現(xiàn)顯著的增殖抑制和細胞死亡。 基于以上認識，針對C

4、NS內(nèi)T細胞活化后效應維持的分子機制，我們推測：小膠質(zhì)細胞作為CNS內(nèi)最重要的APC,很有可能通過免疫共刺激分子OX40-OX40L在其中起重要作用。 目的：觀察小膠質(zhì)細胞OX40L的表達以及LPS、IFN-γ刺激后的表達情況；了解小膠質(zhì)細胞表達OX40L對活化后T細胞增殖和凋亡的影響。探討OX40-OX40L信號分子在小膠質(zhì)細胞對T細胞活化后免疫效應維持中的作用及機理，對深入認識CNS內(nèi)T細胞免疫應答過程及防治相關(guān)疾病提供實驗

5、依據(jù)。 方法：培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細胞株N9用LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)刺激后，檢測m-TNF-α和NO含量，確定N9活化情況。采用RT-PCR、FACS方法檢測不同時相點N9活化前后免疫共刺激分子OX40L的表達變化，并比較不同劑量的LPS、m-IFN-γ單獨和協(xié)同刺激N9時與OX40L表達的量效關(guān)系。免疫熒光定位檢測OX40L表達。 分離新生小鼠大腦皮層的小膠質(zhì)細胞，根據(jù)細胞生長狀態(tài)、形

6、態(tài)特征及細胞免疫化學法檢測細胞膜上特異性抗原(GSA-IB4)鑒定分離細胞的純度。LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)協(xié)同刺激原代小膠質(zhì)細胞后，細胞免疫化學法檢測細胞活化前后OX40L的表達變化。 密度梯度離心法和尼龍毛法分離小鼠脾臟T細胞，F(xiàn)ACS檢測純度，臺盼藍染色檢測細胞活性。用ConA(5μg/ml)活化T細胞后FACS檢測OX40表達。 將活化后OX40L+的N9經(jīng)60Co30Gy輻照，

7、與活化后OX40+的T細胞共培養(yǎng)，并設(shè)立阻斷組(加入OX40L單克隆抗體)特異性阻斷OX40-OX40L信號后，[3H]-TdR摻入實驗測定T細胞增殖，F(xiàn)ITC-AnnexinV/PI熒光染色后FACS方法檢測T細胞凋亡。 結(jié)果：小鼠小膠質(zhì)細胞株N9活化前在mRNA和蛋白水平有OX40L組成性低表達。經(jīng)LPS(500ng/ml)、m-IFN-γ(100U/ml)活化后表達顯著提高。在表達時相上，與N9活化早期12h以內(nèi)上調(diào)表達的

8、分子MHCⅡ及免疫共刺激分子CD80、CD86、CD40相比，OX40L的表達較晚，F(xiàn)ACS結(jié)果顯示，OX40L在活化后24h表達明顯升高。 用不同劑量的LPS和m-IFN-γ活化N9后顯示，OX40L的表達水平與刺激劑量呈現(xiàn)量效關(guān)系。LPS與m-IFN-γ共同刺激時對誘導OX40L表達有協(xié)同效應。 免疫熒光結(jié)果證實OX40L表達于N9細胞膜表面。 原代小膠質(zhì)細胞活化前無OX40L表達，活化后有陽性表達。

9、 活化后小膠質(zhì)細胞上OX40L的表達可明顯增強活化后T細胞增殖，抑制T細胞凋亡。 結(jié)論：本研究在體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞株N9和原代小膠質(zhì)細胞上，首次發(fā)現(xiàn)活化后小膠質(zhì)細胞膜表面表達免疫共刺激分子OX40L，并初步證實該分子可通過結(jié)合并激活T細胞上的OX40信號，促進T細胞增殖，其機制之一為抑制T細胞凋亡，從而可能在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的T細胞免疫應答效應中發(fā)揮重要作用。這一發(fā)現(xiàn)的意義在于有助于揭示中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)固有細胞直接參與T細胞效