Smoothened（Smo）siRNA對結腸腺癌Lovo細胞Smo基因表達及細胞增殖與凋亡的影響.pdf

1、結直腸癌(colorectalcancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴重危害著人類的健康與生命。目前認為，結直腸癌的發(fā)生是機體內因(結直腸癌的遺傳易感性)和外因(飲食和環(huán)境因素)共同作用的結果。大量實驗證明結直腸癌的發(fā)生與基因改變密切相關，正常粘膜細胞在生長、分化過程中出現(xiàn)癌基因的激活、抑癌基因的失活與丟失都可能導致結直腸癌的發(fā)生，其癌變過程可能涉及多個基因、多個位點的突變與丟失。通過對結直腸癌發(fā)生發(fā)展有關的基因研究，不僅可

2、以進一步明確結直腸癌的發(fā)生機制，同時也為結直腸癌的生物治療提供新的靶向。 近年來，研究發(fā)現(xiàn)很多在胚胎發(fā)育、組織分化過程中起調控作用的信號通路同樣在腫瘤發(fā)生的過程中發(fā)揮著重要的作用，其中包括EGFR信號通路、TGF-β信號通路、Sonichedgehog信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路等在動物發(fā)育中起重要作用的信號通路，都在腫瘤中發(fā)現(xiàn)了突變?！翱刂萍棺祫游锱咛グl(fā)育的信號通路可能與人類腫瘤的發(fā)生有關”這一觀點的提出，為腫

3、瘤發(fā)生機制的研究提供了新的方向。 Sonichedgehog信號通路是人類胚胎發(fā)育過程中調控細胞增殖和組織分化的重要信號通路。Sonichedgehog信號通路主要由分泌型信號糖蛋白Sonichedgehog(Shh)配體、跨膜蛋白受體patched(Ptc)和另一跨膜蛋白smoothened(Smo)組成的復合物，以及下游轉錄因子Gli蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)組成。近年來，研究發(fā)現(xiàn)人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Sonic

4、hedgehog信號通路的異常激活密切相關。如在基底細胞癌、小細胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、髓母細胞瘤、胃癌、食道癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌等腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)Sonichedgehog信號通路關鍵成員的突變或異常表達。同樣在結直腸癌組織中也發(fā)現(xiàn)了Sonichedgehog信號通路的關鍵成員Shh、Ptc的高表達，體外細胞實驗提示外源性Shh能促進結腸上皮細胞和腫瘤細胞的增殖，而抗Shh抗體能抑制結腸上皮細胞和腫瘤細胞的增殖。 綜觀以往

5、有關結直腸癌與Sonichedgehog信號通路異常激活的研究，均著重于對Shh配體的作用研究，對于Sonichedgehog信號通路中其它成員的研究較少。Smo蛋白是Sonichedgehog信號通路的關鍵成員，對信號通路具有激活作用。有關Smo基因在結直腸癌發(fā)生中的作用，目前尚未見研究報道。 本課題擬應用Westernblot及半定量RT-PCR技術檢測結腸腺癌Lovo細胞內Smo基因的表達水平，探討Smo基因與結直腸癌的關

6、系，再應用RNAi技術通過轉染體外合成的特導性SmosiRNA進入Lovo細胞內降解Lovo細胞內的SmomRNA表達，最后應用MTT法、流式細胞術檢測SmomRNA被降解后Lovo細胞增殖水平與凋亡水平的變化，探討Smo基因在結直腸癌中的作用。 目的: 探討Smo基因與結直腸癌的關系，以及Smo基因在結直腸癌中的作用，為Smo基因位點上阻斷Sonichedgehog信號通路靶向治療結直腸癌提供實驗依據(jù)。 材料與

7、方法: 1、細胞來源：本實驗所使用的結腸腺癌Lovo細胞株購于中山大學實驗動物中心。主要試劑：總RNA提取試劑異硫氰酸胍(Trizol)、RT-PCR.試劑盒(FSK-100)、兔抗人Smo濃縮型多克隆抗體0.1ml、辣根酶標記羊抗兔IgG多聚體(二抗)、碘化丙啶(PI)、Annexin-V凋亡檢測試劑盒、MTT等。主要設備：CO2恒溫孵育箱、EpicsAltra型流式細胞儀、PCR擴增儀、DYY-40B轉印電印電泳槽、DYY-

8、B型電泳儀。 2、實驗方法：(1)Lovo細胞株于含10％胎牛血清、1％鏈霉素、青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，保持飽和濕度；(2)半定量RT-PCR測定結腸腺癌Lovo細胞的SmomRNA表達；(3)Westernblot印跡檢測結腸腺癌Lovo細胞的Smo蛋白表達；(4)設計并體外化學合成3對SmosiRNA：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3，及1對非特異性siRNA；(5)將

9、Lovo細胞分成A、B、C、D、E五組：A組為轉染特異性siRNA-1組，B組為轉染特異性siRNA-2組、C組為轉染特異性siRNA-3組，D組為陽性對照組(轉染非特異性siRNA)，E組為陰性對照組(轉染時只加Lipofectamine，不加任何siRNA)，每組設6個重復孔。(6)利用陽性脂質體轉染方式分別將SmosiRNA轉染入各組Lovo細胞內；(7)半定量RT-PCR測定轉染后48小時各組Lovo細胞的SmomRNA表達，比

10、較3對SmosiRNA抑制Lovo細胞SmomRNA表達的效果，篩選出抑制Lovo細胞SmomRNA表達最有效的siRNA，后繼實驗中均以該特異性siRNA轉染的細胞為實驗組：(8)再將Lovo細胞分成實驗組、陽性對照組、陰性對照組，每組設6個重復孔進行轉染；(9)MTT法檢測轉染后12h、24h、36h、48h、72h各組Lovo細胞的增殖水平；(10)流式細胞術檢測轉染48h后各組Lovo細胞的凋亡率。 3、統(tǒng)計學分析：所有

11、數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計分析。轉染后不同組Smo基因mRNA水平的比較用完全隨機資料方差分析(One-wayANOVA)，不同時間點不同組Lovo細胞增殖水平的比較用重復測量方差分析，若P<0.05組間差異有統(tǒng)計學意義時，則進一步行LSD多重比較。不同組細胞凋亡率比較用獨立樣本率的χ2檢驗。 結果: 1、Westernblot及半定量RT-PCR檢測結腸腺癌Lovo細胞內Smo蛋白及SmomRNA的表達水平，

12、結果發(fā)現(xiàn)結腸腺癌Lovo細胞內有Smo蛋白及SmomRNA的高表達。 2、轉染48h后，siRNA-1組、siRNA-2組、siRNA-3組及陽性對照組與陰性對照組的Lovo細胞的SmomRNA表達水平有顯著性差異(F=891.496，P<0.001)，siRNA-1組SmomRNA表達水平最低，siRNA-2組次之，兩組分別與陰性對照組比較，差異均有顯著性(P<0.001)；而siRNA-3組、陽性對照組與陰性對照組比較，差異

13、無顯著性(P>0.05)；siRNA-1組與siRNA-2組比較，差異亦有顯著性(P<0.001)。siRNA-1組、siRNA-2組的抑制率分別為63.56％、46.54％，siRNA-3組無抑制作用，后續(xù)實驗選擇siRNA-1轉染Lovo細胞作為實驗組。 3、于轉染后12、24、36、48、72h不同時間點，siRNA-1組、陽性對照組及陰性對照組的Lovo細胞的增殖水平有顯著性差異(F=359.299，P<0.001)，s

14、iRNA-1組Lovo細胞的增殖水平在不同時間點均顯著低于陰性對照組(P<0.05)。 4、于轉染48h后，siRNA-1組、陽性對照組及陰性對照組的Lovo細胞的凋亡率分別為21.7％、10.1％、4.4％，siRNA-1組細胞凋亡率較陽性對照組和陰性對照組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義χ2=15.909，P<0.001) 結論: (一)結腸腺癌的發(fā)生與Smo基因的高表達有關。 (二)Smo基因的高表達與