哮喘氣道杯狀細胞特有hCLCA1的體外表達及自裂解分泌型形式的鑒定.pdf

1、【研究背景】
　　哮喘的臨床特征表現(xiàn)為氣道高反應性和氣道黏液高分泌,慢性非特異性氣道炎癥是哮喘重要的發(fā)病機制。黏液高分泌是哮喘患者肺功能下降,以及致死性哮喘發(fā)生的因素之一,但目前臨床尚缺乏抑制黏液高分泌的手段。氣道上皮杯狀細胞數(shù)量增多是黏液高分泌的病理基礎,探討杯狀細胞的病變機制是控制該臨床癥狀的突破口。已有的研究證實,人鈣激活氯離子通道I型(human calcium-activated chloride channel1,hC

2、LCA1)作為新生杯狀細胞的特異性表達蛋白,通過調控黏蛋白5AC(Mucin5AC,MUC5AC)的合成,在氣道黏液合成及分泌過程中扮演了重要角色。hCLCA1和小鼠鈣激活氯離子通道III型Murine calcium-activated chloride channel type3,mCLCA3)是異種同源蛋白,分別在各自的物種氣道黏液高分泌中起著關鍵作用。早期人們認為它們是一種跨膜通道離子蛋白,但近年國外的研究小組發(fā)現(xiàn),mCLCA3

3、和hCLCA1是分泌型蛋白,可以自裂解為N端的75 kD和C端的35 kD的兩個獨立結構,可能N端能作為獨立的個體行使全長的功能,通過對膜氯離子通道蛋白的調控作用,來實現(xiàn)對黏液蛋白合成與分泌的調節(jié)。同時,鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channel,CLCA)與氣道炎癥的形成也存在密切的關系,甚至可能互為因果。體外表達和純化 hCLCA1是進一步研究該蛋白功能的基礎和前提,同時,進一步驗證hCL

4、CA1的存在形式有利于揭示該蛋白的作用機制。
　　【目的】
　　觀察 hCLCA1在離體的上皮細胞模型 NCI-H292細胞中的表達及分泌情況,探討 hCLCA1作為氣道炎癥介質的可能性。本課題組前期的動物實驗已經(jīng)證實mCLCA3對小鼠哮喘模型的炎癥及黏液分泌具有促進作用,mCLCA3的抗體可以阻斷哮喘小鼠模型的炎癥進程,對炎癥的發(fā)展有一定的阻斷作用。本實驗對 mCLCA3的異種同源蛋白hCLCA1的N端的蛋白在大腸桿菌內誘

5、導表達,并進行了其N端功能結構區(qū)蛋白純化及鑒定,為進行下一步的蛋白功能研究做準備。通過將 hCLCA1過表達慢病毒感染NCI-H292后,收集上清及細胞沉淀,進行western blotting驗證,觀察hCLCA1在離體人上皮細胞中的合成及自裂解,為hCLCA1在人氣道黏液高分泌癥狀中扮演的角色進行初步研究。
　　【方法與結果】
　　1.成功構建hCLCA1全長的真核及N端的原核質粒。⑴將N端約2200 bp目的片段插入p

6、ET28a載體,用SalI及Xhol1對重組質粒進行雙酶切,得到大小為2200 bp的片段,與預期結果相符。測序表明重組質粒pET28a(+)/hCLCA1-N構建成功。⑵將hCLCA1全長基因約2935 bp目的片段插入pEGFP-N1載體,用SalI及BglII對重組質粒進行雙酶切,得到大小為2935 bp的片段,與預期結果相符。測序重組質粒EGFP-N1(+)/hCLCA1構建成功,可以進行下一步的轉染試驗。⑶利用轉染試劑Tube

7、rfect在HEK293細胞中轉染EGFP-N1(+)/hCLCA1重組質粒,細胞轉染后不同時間觀察綠色熒光蛋白表達。結果顯示hCLCA1可以在NCI-H293細胞中成功表達。24 h后取出細胞爬片,利用DAPI進行核染色觀察細胞定位。結果顯示GPF-hCLCA1在細胞核周圍的細胞器中表達量較高。
　　2.hCLCA1-N蛋白的誘導表達、純化及鑒定。⑴誘導pET28a(+)/hCLCA1-N轉化的BL21菌株,經(jīng)篩選獲得最佳表達時

8、間(5 h)、溫度(30℃)、濃度(0.5 mmoL/L)。⑵以最佳條件進行蛋白誘導表達,在冰上進行充分的超聲裂解,分別對收集到的上清、沉淀樣品進行凝膠電泳檢測。實驗表明,我們的目的蛋白大多數(shù)存在沉淀樣品中,約占80％。⑶對蛋白進行His鎳柱純化,SDS-PAGE電泳顯示獲得純度較高的目的蛋白,Western blotting在70 kD分子量大小附近有一條明顯條帶;而在未誘導細菌總蛋白中無該條帶。結果顯示,所純化的Hish-hCLCA

9、1-N融合蛋白正確,為下一步實驗的hCLCA1的單克隆抗體制備及后續(xù)的抗體干預細胞功能提供了條件。
　　3.對hCLCA1進行了慢病毒載體的包裝并感染NCI-H292細胞。⑴將慢病毒包裝輔助質粒與穿梭質粒經(jīng)轉染試劑Turbofect轉染HEK293細胞,免疫熒光結果顯示48h后 HEK293細胞的表達情況良好,轉染效率較高。⑵收集病毒上清,感染NCI-H292細胞48h后,收集細胞及上清做Western Blotting檢測,結果

10、顯示在細胞上清中可以檢測到60 KD的蛋白,在細胞中檢測到60 KD及130 KD左右的蛋白,去除EGFP片段大小后說明hCLCA1蛋白可以在NCI-H292細胞內自裂解為N端和C端兩個獨立結構。這為后期將分泌的上清蛋白進行上皮細胞及淋巴細胞的趨化及黏附功能的研究打下基礎。
　　【結論】
　　1.本實驗合成了人的hCLCA1-N段胞外活性肽段,進行了蛋白的原核表達和純化,為后期針對人hCLCA1的抗原合成打下了基礎。