多孔絲素蛋白膜材料的血管化進程研究.pdf

1、多孔絲素蛋白膜(PSFFs)是具有良好的機械性能和理化性質，如柔韌性和抗拉伸強度、降解性、有效的血管化能力等，所以在醫(yī)學上廣泛應用于人造血管、皮膚、骨來代替、修補、輔助修復人體組織器官。利用多孔絲素蛋白膜輔助修復真皮時，必然要求能夠快速有效地血管化，而多孔絲素蛋白膜血管化過程是多孔絲素蛋白膜材料、細胞因子、細胞和細胞外基質等因素相互協(xié)調作用和適應的過程。但是生物材料中血管新生的細節(jié)及至材料與機體組織協(xié)同作用的的創(chuàng)傷環(huán)境條件下血管化的詳細

2、過程相關的研究報告也比較少。
　　 為了探討多孔絲素蛋白膜材料應用于創(chuàng)傷修復中的血管化機制，需要對材料植入體內時血管化相關的組織細胞與微環(huán)境在組織學和分子生物學水平上探討與研究。本研究以多孔絲素蛋白膜材料在創(chuàng)傷修復時血管化進程的動態(tài)觀察作為研究研究目標。通過對多孔絲素蛋白膜材料血管化過程的超微觀察分析、血管化有關分子如HIF、VEGF、整合素αvβ3和血管內皮細胞CD34等免疫組化分析，反轉錄聚合酶鏈式擴增結合技術(RT-PCR

3、)等手段對絲蛋白生物材料植入大鼠真皮層以后的血管化相關因子HIF、VEGF及受體、Ang-1的行為趨勢等進行觀察與分析，以期探究材料與組織共存情況下的血管新生過程的真實面貌，從而在分子水平和免疫組化水平對多孔絲素蛋白膜材料血管化過程進行系統(tǒng)研究。
　　 研究的內容主要分為以下三個部分：
　　 第一部分為毛細血管形態(tài)學變化過程的實驗跟蹤研究及結果。這部分的工作采用蘇木素伊紅(HE)染色從組織形態(tài)學上對血管形成過程和模式進行

4、分析，并用透射電鏡的方法從超微結構分析內皮細胞形成的毛細血管成熟過程進行觀察，并對血管新生模式進行分析。結果說明了多孔多孔絲素蛋白膜材料內的血管化過程是血管網從無到有，再從有經調整到優(yōu)化、合理的血管網的過程以及內皮細胞從少到多，形成新生毛細血管成熟的生長階段。手術7天后多孔多孔絲素蛋白膜材料周圍血管主要以出芽方式侵入材料，內皮細胞周圍沒有完整的基底膜；25天后主要是血管網形成，以套疊方式優(yōu)化血管，內皮細胞和周細胞連接緊密、基底膜完整。在

5、利用多孔絲素蛋白膜材料進行真皮創(chuàng)傷修復過程中，植入早期血管主要以出芽方式新生，而隨著修復過程的進行，血管新生方式中出芽方式逐漸減少，而套疊方式逐漸增多，創(chuàng)傷修復后期毛細血管主要以套疊方式新生。
　　 第二部分為毛細血管新生過程的免疫組化實驗跟蹤研究及結果。這部分的工作通過制備創(chuàng)傷動物模型，以免疫組化的方法研究HIF、VEGF、血管內皮細胞標記物CD34、整合素avβ3和纖維連接蛋白(FN)、層連接蛋白(LN)在PSFFs和PVA

6、創(chuàng)傷修復中表達的時相性變化，對他們定位、定性和定量研究，并對他們的變化趨勢分析，從而進一步探討多孔絲素蛋白膜材料中的創(chuàng)傷修復和血管化的分子機制。按照統(tǒng)計標準，結果表明手術1天時，多孔絲素蛋白膜和PVA材料里的內皮細胞CD34表達陰性，材料里充滿成纖維細胞和炎癥細胞；手術7天，15天，25天時PSFFs中微血管密度(MVD)值分別是3.54，11.6，24.5，與PVA中的MVD值比較，統(tǒng)計分析二者具有顯著差異(P<0.05)。PSFFs

7、中的VEGF在手術1天、7天、15天和25天分值分別是3.4，1.9，2.5，2.6。和PVA相比在手術7天時具有顯著差異(P<0.05)，其他時間段差異不顯著(P>0.05)；手術1天、7天、15天和25天PSFFs中HIF表達分別是12，4.8，8.6，9.0，和PVA相比在1天、15天和25天二者之間沒有顯著差異(P>0.05)，在手術7天時具有顯著差異(P<0.05)。另外本章還研究了血管出芽的標記物整合素avβ3、細胞外基質的

8、主要成分FN和基底膜LN的變化趨勢。得出PSFFs的血管化過程遵循創(chuàng)傷修復血管形成的一般特點，但也體現(xiàn)了自己的優(yōu)越性，加快了修復過程。PSFFs比PVA具有良好的血管化能力，并且有利于細胞入侵、血管新生、細胞外基質的重建，從而使組織修復達到良好的效果。另外此結果對血管在多孔絲素蛋白材料中的生長模型進行了完善。
　　 第三部分為以分子生物學的方法對毛細血管新生過程相關分子，生長因子進行實驗跟蹤研究及結果。這部分的工作通過逆轉錄－聚

9、合酶鏈式反應(RT-PCR)方法對VEGF及受體、Ang-1、整合素、HIF進行擴增，觀察他們在4個時間段的變化趨勢。結果顯示VEGF、HIF和整合素的變化趨勢和免疫組化結果一致。PSFFs植入活體后血管形成相關分子為適應環(huán)境發(fā)生了相關的改變。
　　 通過以上三部分內容的研究，對多孔絲素蛋白膜材料植入實驗中的血管形成過程進行了系統(tǒng)觀察分析與研究，通過與對照材料PVA實驗結果比較，確認了絲素蛋白膜材料在創(chuàng)傷修復中提供有利于毛細血管

10、新生的正常生理微環(huán)境；在毛細血管形成中各種相關因子的動態(tài)過程檢測或是毛細血管形態(tài)數(shù)量變化實驗結果，都顯示了與PVA材料有顯著性差異。
　　 研究觀察到在多孔絲素蛋白膜植入體內的血管新生過程中，修復進程前期主要以出芽方式新生、后期主要以套疊新生。在絲素蛋白材料中看到這一現(xiàn)象，為這一現(xiàn)象在新的條件下的再現(xiàn)提供實驗證據。
　　 對多孔絲素膜蛋白材料血管化過程，首先通過對創(chuàng)傷修復進程進行組織學和透射電鏡的顯微追蹤觀察；其次通過免