Ⅰ-HIV-1Vpr介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯的研究Ⅱ-成骨不全癥患者組織病理特征分析.pdf

1、本文對(duì)HIV-1Vpr介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯及成骨不全癥患者組織病理特征進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　 第一部分：HIV-1 Vpr介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期阻滯的研究。人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency vires type l，HIV-1)編碼的Vpr(viral protein regulatory)是一種96個(gè)氨基酸的病毒基因產(chǎn)物，分子量為14kd，通過(guò)與gag前體蛋白PR

2、55作用被組裝在核殼體內(nèi)。Vpr參與HIV在胞漿整合前復(fù)合體的核運(yùn)輸，阻滯細(xì)胞周期G2期進(jìn)程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并對(duì)HIV-1長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)和宿主基因轉(zhuǎn)錄反式激活具有調(diào)節(jié)作用。目前研究表明Vpr誘導(dǎo)凋亡的途徑有多種，包括：激活caspase、引起線粒體膜電位的丟失從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、上調(diào)NFlCB抑制子IκB基因的轉(zhuǎn)錄以抑制NFκB介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄等。此外，Vpr的功能受到p53的抑制，這使Vpr在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期G2期阻滯方面

3、具有針對(duì)性。這些研究結(jié)果顯示Vpr在腫瘤基因治療方面有巨大潛力。本研究將巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV)調(diào)控的HIV-1 Vpr基因重組至pcDNA4--HisMax表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Hela、Lovo、HepG2細(xì)胞系，觀察其誘導(dǎo)三種細(xì)胞系G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的效果，以期為Vpr進(jìn)一步應(yīng)用于抗腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 目的：構(gòu)建含有HIV-1 Vpr基因的pcDNA4-Vpr重組載體，體外轉(zhuǎn)染Hela、HepG2、Lovo細(xì)胞系，觀

4、察其抑制三種細(xì)胞系細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的效果。
　　 方法：⑴pcDNA4-CMV-Vpr重組載體的構(gòu)建：通過(guò)Nhe I和BsrG I雙酶切，將 PMD-18T- Vpr重組載體中的Vpr片段連接入pcDNA4-CMV-EGFP載體骨架上。pcDNA4-CMV-Vpr重組載體分別采用質(zhì)粒PCR和酶切驗(yàn)證。⑵Vpr誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和G2期阻滯：以Fugene轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒pcDNA4-CMV-Vpr轉(zhuǎn)染至Hela、

5、Lovo、HepG2細(xì)胞，同時(shí)設(shè) pcDNA4-CMV-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組、僅加Fugene轉(zhuǎn)染試劑對(duì)照組、完全空白對(duì)照組。選取轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，分別以MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，以流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)細(xì)胞周期，以ANNEXINV法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)果：①經(jīng)PCR、酶切鑒定重組載體pcDNA4-CMV-Vpr構(gòu)建成功。②與pcDNA4-CMV--EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染24h、48h、72

6、h后，Hela、 Lovo、HepG2三種細(xì)胞的存活率呈下降趨勢(shì)，G2期阻滯以及細(xì)胞凋亡率呈上升趨勢(shì)。Hela、Lovo、HepG2在轉(zhuǎn)染后的存活率分別為72.65％、70.33％、68.33％；G2期細(xì)胞周期阻滯為24.9％、18.8％、32.1％；凋亡率分別為15.46％、7.7％、41.5％。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了重組載體pcDNA4-CMV-Vpr，并用Fugene轉(zhuǎn)染試劑法將其轉(zhuǎn)入Hela、Lovo、HepG2

7、三種細(xì)胞系。通過(guò)MTS、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析、ANNXIN V細(xì)胞凋亡檢測(cè)驗(yàn)證了該重組載體誘導(dǎo)Hela，Lovo、HepG2細(xì)胞G2期阻滯和細(xì)胞凋亡的作用，為Vpr進(jìn)一步應(yīng)用于抗腫瘤基因治療奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分：成骨不全癥患者組織病理特征分析。成骨不全癥(osteogenesis imperfecta，OI)是一類常染色體遺傳病。主要發(fā)病機(jī)制為Ⅰ型膠原相關(guān)基因發(fā)生變異導(dǎo)致Ⅰ型膠原蛋白缺失或合成不良。臨床表現(xiàn)為患者骨脆性增

8、加、鞏膜發(fā)藍(lán)、皮膚松弛、骨骼肌和韌帶松弛等。其病理特點(diǎn)為：編織骨相對(duì)增多但難以轉(zhuǎn)變?yōu)榘鍖庸?，骨?xì)胞數(shù)量增加，骨小梁纖細(xì)且排列紊亂等。
　　 目的：制備、分析成骨不全癥患者皮膚、骨骼肌、骨骼組織HE染色切片，觀察其病理特征。
　　 方法：收集87例成骨不全癥患者皮膚、骨骼肌、骨骼組織，常規(guī)石蠟制片、HE染色，觀察其顯微結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：HE染色下，多數(shù)成骨不全癥患者皮膚組織無(wú)病理性變化，僅2例表現(xiàn)為皮膚膠原纖維層

9、變厚和玻璃樣變；骨骼肌樣本大多存在肌纖維萎縮現(xiàn)象，27例表現(xiàn)為肌間脂肪增多，16例表現(xiàn)為肌間膠原纖維增生，20例表現(xiàn)為肌漿溶解；6例患者骨組織表現(xiàn)為纖維／結(jié)締組織增生，對(duì)照組病例未觀察到明顯病理變化。
　　 結(jié)論：①成骨不全癥患者皮膚樣本中兩例存在膠原纖維增生和玻璃樣變，其余均正常。②患者骨骼肌樣本中32.15％的病例表現(xiàn)為肌問(wèn)脂肪增多，19.05％表現(xiàn)為肌間膠原纖維增生，23.81％表現(xiàn)為肌漿溶解。③19.05％的成骨不全患者