楊樹FLC基因的研究——楊樹FLC基因家族的生物信息學分析及小黑楊PnFLC1基因的克隆和表達分析.pdf

1、模式植物擬南芥的成花誘導(dǎo)途徑研究得已經(jīng)很清楚，擬南芥FLC(Flowering LocusC)基因在成花誘導(dǎo)途徑中處于樞紐位置，是春化途徑和自主途徑的關(guān)鍵基因，F(xiàn)LC上調(diào)表達可以抑制下游基因SOC1和FT的表達，從而抑制開花，反之FLC下調(diào)表達促進開花。楊樹是否也存在著和擬南芥相似的成花途徑，楊樹中FLC基因的功能和開花的關(guān)系如何，有待于研究。針對上述問題，進行如下研究:
　　(1)生物信息學方法在楊樹全基因組中鑒定了FLC基因家

2、族的13個基因成員，蛋白質(zhì)序列分析表明，13個基因的蛋白序列都具有MADS-box家族典型的M結(jié)構(gòu)域，一些基因還分別具有I、K、C結(jié)構(gòu)域。染色體定位分析顯示，PtrFLC-10(745710)和PtrFLC-11(678188)位于scaffold上，其他11個基因分布在9條染色體上。表達聚類分析表明，每個基因在不同組織表達具有差異性。
　　(2)篩選出擬南芥早花突變體flc植株的純合體21株，該突變體與野生型相比早花約7天，此突

3、變體SALK_103719.45.30.x被敲除的基因FLC(Genebank Accession:NM_121052)與楊樹FLC基因家族中的PtrFLC-13(758707)編碼的蛋白相似度達49％，以PtrFLC-13基因序列設(shè)計引物，克隆出小黑楊中的PnFLC1基因，全長726bp，與PtrFLC-13僅存在3個堿基的差異，在蛋白序列上完全一致。實時熒光定量PCR顯示，該基因在花芽中表達量最高，其次為莖、葉，在根中的表達量最低，

4、春化作用處理后，該基因在根、莖、葉組織中的表達量均下降。
　　(3)成功構(gòu)建pET52b-PnFLC1原核表達載體，轉(zhuǎn)化至BL21菌株后，確定了融合蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度為30℃，最佳誘導(dǎo)時間為8h。用此重組質(zhì)粒制備得到的多克隆抗體與原核表達的融合蛋白western blot雜交，檢測抗體具有特異性。
　　(4)用酶切、連接方法構(gòu)建了pROKⅡ-PnFLC1植物過表達載體，利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了RNAi抑制表達載體，經(jīng)測序