PML及PML——NBs調(diào)控細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、細(xì)胞內(nèi)多種機(jī)制都執(zhí)行著“寧死勿錯(cuò)”這一規(guī)則，這就意味著那些基因組受損或失調(diào)的細(xì)胞將會(huì)通過細(xì)胞凋亡的方式被剔除，以維持機(jī)體的正常功能。一旦細(xì)胞凋亡調(diào)控出現(xiàn)障礙，細(xì)胞自穩(wěn)平衡受到破壞，機(jī)體就可能出現(xiàn)諸如腫瘤、自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性病變等疾病，因此細(xì)胞凋亡研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。新近的研究發(fā)現(xiàn)早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(PML)在多個(gè)凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，PML缺失能夠顯著抑制電離輻射、CD95／Fas、神經(jīng)酰胺、TN

2、F、IFN等誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。研究揭示：PML借助N端的RBCC結(jié)構(gòu)自身寡聚化并募集其它蛋白形成其賴以發(fā)揮功能的PML-NBs，一個(gè)與核基質(zhì)相連的、動(dòng)態(tài)的亞核多蛋白復(fù)合物，它作為染色質(zhì)問區(qū)室(IC)的功能單位，滿足了高層次真核基因表達(dá)調(diào)控模式的時(shí)空要求，參與調(diào)控多種重要的細(xì)胞學(xué)事件。對(duì)于PML及PML-NBs在細(xì)胞凋亡中的功能作用，Bemardi精辟的概括為：PML及PML-NBs可以作為一種分子接線板選擇性地動(dòng)態(tài)地調(diào)控凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄事件

3、，誘導(dǎo)或／和增強(qiáng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 新的研究進(jìn)展揭示：細(xì)胞凋亡調(diào)控中特別引人關(guān)注的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子p53和Daxx均能夠定位到PML-NBs，并且三者間兩兩相互作用形成了在細(xì)胞凋亡調(diào)控具有重要功能意義的PML-p53-Daxx轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)于這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的研究發(fā)現(xiàn)：p53定位到PML-NBs后發(fā)生特異位點(diǎn)的磷酸化和乙?；?，這些修飾直接促進(jìn)了p53轉(zhuǎn)錄激活下游凋亡相關(guān)基因進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞凋亡的功能；對(duì)于Daxx來說，在PML-NBs中的定

4、位也是其發(fā)揮凋亡調(diào)控功能所必須的；而Daxx能夠調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄激活能力，并且這種調(diào)控關(guān)系同樣受到PML的調(diào)控。由此可以看到：PML、p53、Daxx三者間調(diào)控關(guān)系的研究對(duì)于揭示細(xì)胞凋亡調(diào)控功能具有尤為重要的科學(xué)意義。而已有的研究也同時(shí)提示：PML對(duì)于p53的調(diào)控是復(fù)雜，除了對(duì)修飾的調(diào)控可能還存在其它的調(diào)控形式；雖然已經(jīng)證實(shí)Daxx可以調(diào)控p53的轉(zhuǎn)錄激活能力，但是對(duì)于究竟是抑制還是增強(qiáng)尚無定論?另外，Daxx是否還可以通過其它的途徑，

5、如穩(wěn)定性來調(diào)控p537PML又是如何調(diào)控Daxx對(duì)p53的調(diào)控?這些科學(xué)問題正是我們所關(guān)心的，本研究?jī)H就其中的部分問題進(jìn)行了探索，并取得了以下的研究進(jìn)展： 1．檢測(cè)了多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中PML的表達(dá)，在血液腫瘤細(xì)胞系中PML普遍低表達(dá)，而實(shí)體腫瘤細(xì)胞系多表達(dá)正常；采用RNAi技術(shù)成功構(gòu)建了穩(wěn)定抑制PML表達(dá)的MCF-7細(xì)胞模型，為PML功能的研究打下了良好基礎(chǔ)。 2．利用該模型研究發(fā)現(xiàn)PML缺失導(dǎo)致p53與MDM2結(jié)合增加，

6、穩(wěn)定性降低，并且在電離輻射造成的DNA損傷反應(yīng)中p53與PML的結(jié)合增加，而和MDM2結(jié)合減少，說明PML可能通過與MDM2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合p53而提高p53的穩(wěn)定性；p53反應(yīng)元件熒光素酶報(bào)道載體實(shí)驗(yàn)揭示PML缺失導(dǎo)致p53轉(zhuǎn)錄激活能力明顯降低，在電離輻射造成的DNA損傷反應(yīng)中亦是如此；對(duì)內(nèi)源性p53下游基因的檢測(cè)顯示，PML缺失導(dǎo)致DNA損傷反應(yīng)中p53激活促凋亡基因Bax的能力幾乎喪失，誘發(fā)的細(xì)胞凋亡能力也受到明顯抑制，lOCyY．射線照

7、射MCF-7細(xì)胞，PML干涉細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例僅為未干涉細(xì)胞的60％左右。 3．克隆并構(gòu)建了PML-IV和p73a、p73p的真核表達(dá)載體，并且采用p21啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)道載體研究證實(shí)PML-IV能夠促進(jìn)p73a對(duì)p21的轉(zhuǎn)錄激活，PML缺失能夠顯著抑制p73對(duì)p2l的轉(zhuǎn)錄激活，PML缺失細(xì)胞中p73激活p21啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光素酶的表達(dá)僅為未干涉細(xì)胞中的60％左右。 4．通過對(duì)p21、Noxa、survivin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的

8、熒光素酶報(bào)道載體的研究證實(shí)：Daxx過表達(dá)可以抑制p53對(duì)周期阻滯基因p2l和促凋亡基因Noxa的轉(zhuǎn)錄激活，而對(duì)p53轉(zhuǎn)錄抑制survivin沒有影響；Daxx對(duì)p53轉(zhuǎn)錄激活p21的抑制可以被PML-IV所解除；克隆構(gòu)建了Daxx表達(dá)載體，并且得到了穩(wěn)定表達(dá)Daxx的細(xì)胞模型；研究證實(shí)在Hela和MCF-7細(xì)胞中過表達(dá)Daxx可以增加p53蛋白的表達(dá)量；構(gòu)建了PML-IV和Daxx的可誘導(dǎo)表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，并且成功得到了包裝高滴度

9、(>106)攜帶PML-IV和Daxx基因病毒的PA317細(xì)胞株。 5．建立了組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的模型，并研究發(fā)現(xiàn)300nM的TSA即可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變；PML、p53在TSA誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯增加，而Daxx變化不明顯，p53下游的MDM2、p21、Bcl-2、survivin表達(dá)都呈升高趨勢(shì)。 通過對(duì)PML-p53-Daxx轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究發(fā)現(xiàn)：PML分子除了可

10、以通過調(diào)控p53的翻譯后修飾增加p53轉(zhuǎn)錄激活下游凋亡相關(guān)基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，還可以通過增加p53的穩(wěn)定來協(xié)同p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)PML也可以增加p53家族另一個(gè)成員p73轉(zhuǎn)錄激活p21的能力；此外同樣定位在PML-NBs中的Daxx可以抑制p53對(duì)p2l和Noxa的轉(zhuǎn)錄激活，而不影響p53對(duì)survivin的轉(zhuǎn)錄抑制，PML-IV可以解除Daxx對(duì)p53轉(zhuǎn)錄激活p21的抑制；研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Daxx可以明顯增加p53蛋白的表達(dá)