溫?zé)嵴T導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及JNK的調(diào)控機制研究.pdf

1、研究背景:
　　胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類的身心健康。我國預(yù)計每年死于胃癌的患者達(dá)16萬以上，占癌癥死亡人數(shù)的23％，其死亡率仍居我國的首位。目前胃癌仍以手術(shù)治療為主，但胃癌的早期診斷率很低，大多數(shù)患者一經(jīng)診斷往往已是晚期而失去手術(shù)的機會。而全身化療是晚期胃癌姑息性治療的主要手段，但目前胃癌的化療尚沒有理想的“金標(biāo)準(zhǔn)”，且毒副作用大。腫瘤熱療是繼手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療和生物治療之后的第5大腫瘤治療手段。尤其在晚期

2、惡性腫瘤或難治性腫瘤治療方面，其最大優(yōu)點是無創(chuàng)或微創(chuàng)，可與放化療具有協(xié)同和增敏作用，并又能減輕放化療的副反應(yīng)。熱療在腫瘤綜合治療中的地位及意義受到越來越多的關(guān)注。大量研究表明誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是溫?zé)釟[瘤細(xì)胞的主要機理之一，但其機制目前尚不清楚。
　　C-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)是機體應(yīng)激的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能被多種刺激因素激活而介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。但也有研究顯示JNK有抗細(xì)胞凋亡的作用

3、，提示JNK信號在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中具有復(fù)雜性、多樣性。因此目前認(rèn)為JNK促凋亡或抗凋亡活性可能與細(xì)胞類型、死亡刺激以及其它信號通路活性有關(guān)。溫?zé)釋儆谝环N熱應(yīng)激，在溫?zé)釕?yīng)激誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中，是否存在JNK的參與及JNK信號起何種調(diào)控作用？國內(nèi)外尚無相關(guān)報道。因此，研究JNK在溫?zé)嵴T導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用及其機制，可能為胃癌的防治提供一個新的靶點，為臨床胃癌防治提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的:
　　1.探討JNK蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

4、特點及其與胃癌的臨床特征的關(guān)系。
　　2.探討溫?zé)釋ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響。
　　3.探討溫?zé)釋ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　4.探測溫?zé)岷笪赴┘?xì)胞的p-JNK以及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Puma、P53、Bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白表達(dá)和JNK、Bax等mRNA表達(dá)。
　　5.探討使用JNK特異性抑制劑SP600125阻斷JNK后溫?zé)嵋鸺?xì)胞凋亡相關(guān)基因Puma、P53、Bcl-2、Bax和Caspase

5、-3等蛋白表達(dá)和JNK、Bax等mRNA表達(dá)變化及其可能的機制。
　　材料和方法:
　　1.研究材料:①臨床標(biāo)本:胃癌標(biāo)本59例，②胃癌細(xì)胞系:MKN45、SGC7901。
　　2.溫?zé)峒?xì)胞模型溫度選擇:43℃。
　　3.細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變:應(yīng)用倒置顯微鏡觀察及透射電鏡觀察。
　　4.細(xì)胞活力的檢測:采用四唑藍(lán)(MTT)比色試驗。
　　5.細(xì)胞凋亡的檢測:采用Hoechst-33258熒光染色、AO

6、/EB熒光雙染色、AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL方法。
　　6.細(xì)胞周期的檢測:采用AnnexinV/PI雙染色流式細(xì)胞術(shù)方法。
　　7.細(xì)胞運動遷移能力的檢測:采用細(xì)胞劃痕愈合實驗。
　　8.細(xì)胞侵襲能力的檢測:采用Transwell實驗。
　　9.胃癌組織及細(xì)胞的JNK信號通路相關(guān)蛋白的檢測:采用免疫組織化學(xué)PV-9000方法及Western blotting方法。
　　10.胃癌細(xì)

7、胞JNK信號通路相關(guān)基因mRNA的檢測:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法。
　　11.胃癌細(xì)胞JNK信號的調(diào)控:采用JNK特異性抑制劑SP600125阻斷的方法。
　　結(jié)果:
　　1.JNK在人胃癌組織中的表達(dá):
　　JNK在胃癌組織中均有表達(dá)，在高、中、低分化胃癌組織中，陽性率分別為92.9％、70.8％和52.4％，呈明顯遞減趨勢(P＜0.05)，高分化胃癌的JNK表達(dá)顯著高于低分化胃癌(P＜0.01

8、)，但JNK與年齡、性別、腫塊大小、PTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（均P＞0.05）。
　　2.溫?zé)釋ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響:
　　(1)倒置顯微鏡檢測結(jié)果表明，溫?zé)?.5h、1h、2h及3h后兩株胃癌細(xì)胞（SGC7901和MKN45）均明顯皺縮、變圓及細(xì)胞漂浮，1h細(xì)胞形態(tài)損傷略輕于0.5h，2h細(xì)胞皺縮、變圓、漂浮明顯增多，3h大部分細(xì)胞出現(xiàn)漂浮，但SGC7901細(xì)胞皺縮、變圓、漂浮的比例高于MKN45細(xì)胞。
　　(2)

9、透射電鏡觀察結(jié)果表明，溫?zé)?.5h、1h后部分SGC7901細(xì)胞可見核仁增多，胞核及胞質(zhì)可見大小不等的空泡，1h細(xì)胞形態(tài)損傷略輕于0.5h，2h細(xì)胞核固縮、染色體發(fā)生邊集及空泡變性明顯，可見多量凋亡小體。
　　(3)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，溫?zé)?.5h、1h、2h和3 h SGC7901細(xì)胞凋亡率分別為7.3％、46.5％、39.9％、56.6％和50.4％，MKN45細(xì)胞凋亡率分別為8.8％、31.7％、26.7％、46.1％和

10、41.8％，兩株細(xì)胞溫?zé)?h細(xì)胞凋亡率低于0.5h，但SGC7901細(xì)胞各溫?zé)釙r間組的細(xì)胞凋亡率高于MKN45細(xì)胞相應(yīng)溫?zé)釙r間組的細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)。
　　(4) Hoechst-33258熒光染色結(jié)果顯示，與對照組相比，溫?zé)?.5h、1h、2h和3h細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光，顯示出胞核固縮、染色質(zhì)高度凝聚和碎裂，并且溫?zé)?h胞核的變化輕于0.5h，2h又明顯加重。
　　(5) AO/EB熒光雙染色結(jié)果顯示

11、，與對照組相比，溫?zé)?.5h和2h細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，且1h凋亡率低于0.5h，3h細(xì)胞凋亡減少，而細(xì)胞壞死數(shù)量增多。
　　(6) TUNEL檢測結(jié)果顯示，溫?zé)?h、0.5h、1h、2h和3h后SGC7901細(xì)胞和MKN45細(xì)胞凋亡率分別為12.2％、48.2％、40.1％、61.2％、52.0％和11.3％、42.7％、33.4％、48.8％、44.3％;各溫?zé)釙r間組（除0h外）的SGC7901細(xì)胞凋亡率明顯高于MKN45細(xì)胞

12、相應(yīng)溫?zé)釙r間組的細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)，并且溫?zé)?h后細(xì)胞凋亡率低于溫?zé)?.5h。
　　3.溫?zé)釋ξ赴┘?xì)胞的生物學(xué)行為的影響:
　　(1) MTT結(jié)果顯示，溫?zé)?.5h、1h、2h和3h后SGC7901和MKN45細(xì)胞抑制率分別為32.7％、30.6％、43.8％、52.9％和23.0％、18.7％、33.8％、39.9％，上述兩株細(xì)胞溫?zé)?h后細(xì)胞抑制率低于0.5h。提示溫?zé)峥蓺赴┘?xì)胞，且對SGC7901細(xì)胞殺傷作

13、用強于MKN45細(xì)胞(P＜0.05);胃癌細(xì)胞自身對溫?zé)釙a(chǎn)生一定的應(yīng)激能力。
　　(2)細(xì)胞劃痕愈合實驗結(jié)果顯示，SGC7901細(xì)胞溫?zé)?、2h后24h的細(xì)胞遷移距離分別為489.0±13.5pixels、254.0±19.7pixels，均小于37℃對照組的細(xì)胞遷移距離689.1±9.8pixels(P＜0.05)，SGC7901細(xì)胞加熱1、2h后48h的細(xì)胞遷移距離分別為707.0±18.4pixels、259.7±17.3

14、pixels，均明顯小于37℃對照組的細(xì)胞遷移距離984.0±21.3pixels((P＜0.01)，溫?zé)?h后細(xì)胞基本未發(fā)生遷移。
　　(3)體外侵襲實驗（Transwell實驗）結(jié)果顯示，SGC7901細(xì)胞溫?zé)?h后細(xì)胞侵襲能力下降最明顯，對照組和溫?zé)?.5h、1h、2h、3h后，平均每個視野SGC7901細(xì)胞穿過Matrigel膠到達(dá)Transwell小室膜背面的細(xì)胞數(shù)分別為44.4±0.81、30.5±1.05、34.0±

15、1.36、20.5±0.91、8.4±0.92，與對照組比較均具有差異(P＜0.05)。
　　(4)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，SGC7901細(xì)胞各溫?zé)釙r間組的G0-G1期細(xì)胞均增多(P＜0.05)，而S期細(xì)胞減少(P＜0.05)，各溫?zé)釙r間組的MKN45細(xì)胞周期變化不顯著(P＞0.05)。
　　4.溫?zé)岷笪赴㏒GC7901細(xì)胞的p-JNK及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Puma、P53、Bcl-2、Bax和Caspase-3等

16、蛋白表達(dá):
　　Western blotting結(jié)果顯示，與對照組的細(xì)胞p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平比較，0.5h至2h各時間組的細(xì)胞p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05);2h組達(dá)最高峰，1h組低于0.5h組，3h組的細(xì)胞上述指標(biāo)明顯回落(P＜0.05); Bcl-2表達(dá)在溫?zé)?.5h組增高，1h組達(dá)高峰，而后明顯下降。提示溫?zé)嵴T導(dǎo)胃癌SGC79

17、01細(xì)胞凋亡過程中p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3等蛋白均被激活;而Bcl-2作為抗凋亡蛋白，在溫?zé)岽碳み^程中開始增高，而后下降，可能是一種保護(hù)作用。P53蛋白未表達(dá)，其原因可能是野生型P53半衰期短，難以檢測到。
　　5.溫?zé)岷笪赴㏒GC7901細(xì)胞的JNK及Bax的mRNA表達(dá):
　　RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組的JNK、Bax的mRNA表達(dá)水平比較，0.5h至2h各溫?zé)釙r間組的JNK、Bax的mRNA

18、表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05);2h組達(dá)最高峰，1h組低于0.5h組，3h組的細(xì)胞上述指標(biāo)明顯回落(P＜0.05)。其結(jié)果與Western blotting檢測相應(yīng)蛋白的結(jié)果相一致。
　　6.探討JNK特異性抑制劑SP600125阻斷JNK后引起細(xì)胞形態(tài)及凋亡相關(guān)基因Puma、P53、Bcl-2、Bax和Caspase-3等蛋白和JNK、Bax的mRNA表達(dá)變化及其可能的調(diào)控機制。
　　(1)倒置顯微鏡及TUNEL檢測結(jié)果

19、表明，與陰性對照組相比，SP600125處理后各溫?zé)釙r間組對細(xì)胞的殺傷作用明顯減弱(P＜0.05)。
　　(2) Western blotting結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，SP600125處理后各溫?zé)釙r間組的p-JNK、Puma、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(P＜0.05);Bcl-2蛋白表達(dá)仍是先增高而后降低;P53蛋白未見表達(dá)。
　　(3) RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，SP600125處理

20、后細(xì)胞各溫?zé)釙r間組的JNK、Bax的mRNA表達(dá)水平明顯降低(p＜0.05)，其結(jié)果與Westernblotting檢測相應(yīng)蛋白的結(jié)果相一致。
　　結(jié)論:
　　1.胃癌組織中存在JNK表達(dá)，并且JNK的表達(dá)隨胃癌分化程度增高而增高(P＜0.05)，而與年齡、性別、腫塊大小、PTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(均P＞0.05)。
　　2.溫?zé)峥烧T導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，溫?zé)嵴T導(dǎo)胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡作用明顯強于MKN45細(xì)胞(P＜