保加利亞乳桿菌胞外多糖誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制.pdf

1、乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外常滲于培養(yǎng)基的一類糖類化合物，有的依附于微生物細(xì)胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的進(jìn)入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖，它們都是微生物適應(yīng)環(huán)境的產(chǎn)物。正是因?yàn)槿樗峋舛嗵蔷哂猩锘钚匀缑庖呋钚?、抗腫瘤和抗?jié)兊扔幸娴谋＝∽饔?，才會掀起廣大學(xué)者對其生理功能，尤其是抗腫瘤活性研究的濃厚興趣。 本研究以保加利亞乳桿菌胞外多糖(Exopoly

2、saccharide produced by Lactobacillus delbruecckii ssp.bulgaricus，L.b.EPS)為研究對象，分別采用MTT比色法、Giemsa染色法、透射電鏡技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、原位末端標(biāo)記法(TUNEL)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)及實(shí)時定量-PCR技術(shù)等從L.6.EPS對人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的抑制作用、L.b.EPS對人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，及L.

3、b.EPS對凋亡關(guān)鍵基因及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用等三方面研究L.b.EPS誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的作用與機(jī)制，為進(jìn)一步研究L.b.EPS抑癌和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)理提供試驗(yàn)依據(jù)。 本研究得到的結(jié)果如下： (1)L.b.EPS對人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長具有抑制作用。 MTT比色法研究發(fā)現(xiàn)，L.b.EPS在10mg·mL<;'-1>、40mg·mL<'-1>的濃度下作用24h，細(xì)胞生長均受到不同程度的抑

4、制，這一抑制作用隨L.b.EPS濃度的升高而增強(qiáng)。并且濃度與生長抑制率呈現(xiàn)明顯的依賴效應(yīng)，40mg·m<'-1>試驗(yàn)組抑制率達(dá)73.81％；同時，L.b.EPS在10mg·mL<'-1>～40mg·mL<'-1>的濃度范圍內(nèi)，這一抑制作用隨L.b.EPS作用時間的延長而增強(qiáng)。時間與生長抑制率也呈現(xiàn)出依賴效應(yīng)，10mg·mL<'-1>試驗(yàn)組抑制率從24h的52.28％提高到72h的65.37％。 (2)L.b.EPS能誘導(dǎo)人胃癌S

5、GC-7901細(xì)胞凋亡。 Giemsa染色法結(jié)果顯示，胃癌SGC-7901細(xì)胞經(jīng)40mg·m<'-1>L.b.EPS作用24h后細(xì)胞逐漸變圓，體積縮小，胞漿濃縮，胞核著色較深且固縮碎裂，胞膜表面有芽狀突起(凋亡前期狀態(tài))，顯示出較為典型的凋亡癥狀和趨勢。透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)40mg·mL<'-1>L.b.EPS作用24h的SGC-7901細(xì)胞，細(xì)胞核縮小，其形態(tài)扭曲并出現(xiàn)斷裂，且結(jié)構(gòu)不完整，呈碎裂狀，染色質(zhì)凝集成不規(guī)則團(tuán)簇，核仁

6、消失，細(xì)胞漿普遍出現(xiàn)空泡，對照組核膜與細(xì)胞膜仍保持完整，核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有20mg·mL<'-1>L.b.EPS作用24h的SGC-7901細(xì)胞提取DNA后，在凝膠上形成較為明顯的梯狀譜帶，其他濃度未出現(xiàn)梯狀譜帶。TUNEL結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著L.b.EPS濃度(10mg·mL<'-1>，20mg·mL<'-1>，40mg·mL<'-1>)的增加，SGC-7901細(xì)胞的胞核區(qū)域的陽性細(xì)胞比率逐漸增加，多糖組凋亡指

7、數(shù)顯著高于空白對照組的凋亡指數(shù)，多糖高劑量組(40 mg·mL<'-1>)作用24h后，凋亡指數(shù)可達(dá)9.84％。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，L.b.EPS呈劑量依賴性地誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，40 mg·mL<'-1>的L.b.EPS促凋亡作用最為明顯，細(xì)胞凋亡率可達(dá)到8.6％。同時L.b.EPS也呈時間依賴性地誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，同時伴有細(xì)胞的壞死，其中10 mg·mL<'-1>作用72h的L.6.EPS對SGC-7901細(xì)胞

8、的促凋亡作用最為明顯，細(xì)胞凋亡率可達(dá)到4.2％。 (3)L.b.EPS對凋亡關(guān)鍵基因及蛋白表達(dá)具有調(diào)控作用。 免疫細(xì)胞化學(xué)和實(shí)時定量-PCR結(jié)果顯示，在體外條件下，L.b.EPS可在mRNA水平和蛋白水平下調(diào)胃癌細(xì)胞bcl-2基因的表達(dá)而上調(diào)bax基因的表達(dá)，誘發(fā)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。 由上述結(jié)果得到以下結(jié)論：體外檢測表明，L.b.EPS對人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。并且bcl-2和bax在L.