孕期高糖對(duì)子代大鼠RAS介導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈血管張力的影響及離子通道機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：高血壓發(fā)病由基因和環(huán)境因素的綜合作用所引起，而孕期營(yíng)養(yǎng)不當(dāng)包括高鹽、高脂肪或低蛋白飲食等作為孕期不良環(huán)境因素與胎源性高血壓發(fā)病密切相關(guān)。愈來愈多的研究證據(jù)表明，孕期母體營(yíng)養(yǎng)不當(dāng)可引起出生低體重兒或肥胖兒，胎兒在其發(fā)育關(guān)鍵階段暴露于母體營(yíng)養(yǎng)失衡的環(huán)境，可對(duì)其心血管發(fā)育產(chǎn)生多種不良影響，可致其在成年期罹患高血壓等心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。高血壓發(fā)病與外周阻力動(dòng)脈管壁增厚及血管張力增強(qiáng)導(dǎo)致的循環(huán)阻力增加有關(guān)。血管張力及血壓調(diào)控與鈣、鉀離

2、子通道功能活動(dòng)密切相關(guān)，其中特別是L-型電壓門控性鈣通道(L-type voltage-gated Ca2+channels，L-Ca2+)與大電導(dǎo)鈣依賴性鉀通道(Large-conductance Ca2+-activated K+channels，BK)對(duì)血管張力及血壓調(diào)控起重要作用。L-Ca2+通道功能活動(dòng)受細(xì)胞膜電位影響，主要調(diào)控細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入平滑肌細(xì)胞內(nèi)，使得細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度(intracellular free Ca

3、2+concentration，[Ca2+]i)升高，誘發(fā)血管收縮；而BK通道作為影響細(xì)胞膜電位的主要通道之一，可被[Ca2+]i升高及膜電位去極化所激活，由此發(fā)揮對(duì)細(xì)胞膜電位及血管張力的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)包括循環(huán)RAS和血管局部組織RAS，作為機(jī)體重要的內(nèi)分泌系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)體液平衡和心血管活動(dòng)方面起重要作用。研究表明高鹽或高糖飲食可誘導(dǎo)動(dòng)物發(fā)生高血壓，其發(fā)病關(guān)

4、鍵環(huán)節(jié)之一在于血管功能異常。然而，孕期高糖飲食是否及如何影響子代血管功能，是否對(duì)成年子代血管RAS及離子通道活動(dòng)產(chǎn)生“印跡”效應(yīng)，從而影響子代血管張力與血壓調(diào)控，目前尚鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬研究孕期高糖飲食對(duì)成年子代大鼠外周阻力動(dòng)脈血管功能調(diào)控的“印跡”效應(yīng)及其離子通道機(jī)制。
　　 第一部分孕期高糖對(duì)子代心血管功能及腸系膜動(dòng)脈血管張力的影響
　　 目的：研究孕期母體高糖飲食對(duì)成年子代大鼠諸如血壓、心率等心血管功能指標(biāo)和腸系膜

5、動(dòng)脈血管張力調(diào)控的“印跡”效應(yīng)，并在離體組織層面初步闡明RAS與BK通道改變?cè)诟咛亲哟庵茏枇?dòng)脈血管張力調(diào)節(jié)中的作用及其對(duì)血壓調(diào)控的影響。方法：實(shí)驗(yàn)組孕鼠從妊娠第1天至妊娠第21天給予孕期全程高糖飲食(正常鼠糧+20％蔗糖水溶液)，對(duì)照組孕鼠給予全程正常飲食(正常鼠糧+自來水)。在臨產(chǎn)前1天通過腹主動(dòng)脈隨機(jī)取部分母鼠血液，用于檢測(cè)血糖；同時(shí)取其胎鼠，稱量體重及檢測(cè)血糖。自然分娩后，在哺乳期內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組母鼠均給予正常飲食，幼鼠進(jìn)行母

6、乳喂養(yǎng)。之后，子代大鼠全部給予正常飲食，生長(zhǎng)至5個(gè)月后用于實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)抽選部分子代成年大鼠，測(cè)體重，并在麻醉?xiàng)l件下通過腹主動(dòng)脈取血用于檢測(cè)血糖。部分子代大鼠行股動(dòng)、靜脈插管術(shù)，以PowerLab生理記錄儀在體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)動(dòng)物清醒無應(yīng)激條件下的血壓、心率等指標(biāo)。部分子代分離腸系膜動(dòng)脈后，制備血管環(huán)，以PowerLab生理記錄儀檢測(cè)血管張力情況，以熒光鈣成像儀檢測(cè)血管細(xì)胞內(nèi)鈣情況。結(jié)果：孕期高糖飲食對(duì)胎鼠和成年子代的血糖無明顯影響，但可引起胎鼠體

7、重增加，而成年子代體重?zé)o明顯差異。孕期高糖飲食對(duì)成年子代在基礎(chǔ)狀態(tài)下的血壓、心率無明顯影響，但靜脈給予血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)刺激后，高糖子代的收縮壓、舒張壓、平均動(dòng)脈壓和心率均出現(xiàn)一過性的明顯升高。在離體條件下，AngⅡ所誘導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈血管張力和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度在高糖組亦明顯升高；分別以BK通道阻斷劑、AT1/AT2受體阻斷劑預(yù)先孵育后，與對(duì)照組相比，高糖子代血管張力出現(xiàn)明顯的不同改變。
　　

8、結(jié)論：孕期高糖飲食可影響成年子代腸系膜動(dòng)脈血管張力及血壓等心血管功能活動(dòng)，可能與血管組織BK通道及AT1/AT2受體改變有關(guān)。
　　 第二部分孕期高糖對(duì)子代腸系膜動(dòng)脈鈣通道功能活動(dòng)的影響
　　 目的：研究孕期高糖飲食對(duì)成年子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞電壓門控性鈣通道功能活動(dòng)和膜電位的影響及其與血管張力調(diào)控的關(guān)系。方法：在體視顯微鏡下分離實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腸系膜動(dòng)脈，以兩步酶解消化法分離血管平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用Axon700B膜片鉗放

9、大器及Clampex10.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄。電壓門控性鈣通道電流以Ba2+作載體，并在電極內(nèi)液中加Cs+及細(xì)胞外液中加TEA和4-AP來阻斷鉀電流，采用傳統(tǒng)全細(xì)胞電壓鉗模式來記錄全細(xì)胞鈣電流。換另一批細(xì)胞，使用記錄鉀電流的細(xì)胞外液與電極內(nèi)液，在傳統(tǒng)全細(xì)胞電流鉗模式(I=0)下記錄細(xì)胞膜電位。結(jié)果：與對(duì)照組相比，孕期高糖組成年子代大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞鈣電流在基礎(chǔ)狀態(tài)下明顯增強(qiáng)，細(xì)胞靜息膜電位發(fā)生明顯去極化改變；給予AngⅡ刺激

10、后，高糖組和對(duì)照組全細(xì)胞鈣電流均增強(qiáng)，高糖組增強(qiáng)的更為明顯，而細(xì)胞膜電位均進(jìn)一步發(fā)生明顯去極化改變。結(jié)論：孕期高糖飲食可明顯增強(qiáng)成年子代大鼠血管平滑肌細(xì)胞電壓門控性鈣通道電流，其功能活動(dòng)的增強(qiáng)可能主要與細(xì)胞膜電位去極化改變有關(guān)。
　　 第三部分孕期高糖對(duì)子代腸系膜動(dòng)脈鉀通道功能活動(dòng)的影響
　　 目的：研究孕期高糖飲食對(duì)成年子代腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鉀離子通道特別是BK通道功能活動(dòng)的影響及其與血管張力調(diào)控的關(guān)系，并探討高糖子

11、代血管RAS受體與BK通道功能活動(dòng)改變的分子基礎(chǔ)及其對(duì)平滑肌細(xì)胞鉀電流的影響。方法：在體視顯微鏡下分離實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組腸系膜動(dòng)脈，以兩步酶解消化法分離血管平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用Axon700B膜片鉗放大器及Clampex10.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，細(xì)胞槽內(nèi)持續(xù)低速灌流記錄鉀電流的細(xì)胞外液，電極內(nèi)充以相應(yīng)的電極內(nèi)液，在傳統(tǒng)全細(xì)胞電壓鉗模式下記錄全細(xì)胞鉀電流。另外，用Western blot方法檢測(cè)腸系膜動(dòng)脈血管BK通道α亞基、AT1及AT2受體蛋白

12、表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組相比，孕期高糖組成年子代大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞全細(xì)胞鉀電流在基礎(chǔ)狀態(tài)下明顯減弱；給予AngⅡ刺激后，高糖組和對(duì)照組鉀電流均進(jìn)一步減少；分別給予AT1/AT2受體阻斷劑Losartan和PD123319預(yù)先孵育后，AngⅡ所誘導(dǎo)的全細(xì)胞鉀電流發(fā)生不同改變。高糖組子代腸系膜動(dòng)脈BK通道α亞基表達(dá)減少，AT1受體表達(dá)增加而AT2受體表達(dá)減少。結(jié)論：孕期高糖飲食對(duì)其成年子代血管平滑肌細(xì)胞鉀離子通道功能活動(dòng)產(chǎn)生“印跡”效應(yīng)，