孕期睡眠剝奪對子代情感和認(rèn)知功能影響及機制研究.pdf

1、第一部分孕期睡眠剝奪對子代情感和認(rèn)知功能的影響
　　目的：研究妊娠不同階段睡眠剝奪后對其子代成年后情感和認(rèn)知功能的影響，采用輕輕觸摸法建立孕期睡眠剝奪大鼠模型，選用其子代大鼠（6-8周齡）為研究對象，觀察孕期不同階段睡眠剝奪對子代行為的影響，為孕期護理和神經(jīng)、精神疾病的治療提供一定的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法：實驗采用Sprague-Dawley孕鼠，按隨機原則分為四個組，分別為正常對照組（CTR組）、妊娠早期睡眠剝奪組

2、（ESD組）、妊娠中期睡眠剝奪組（MSD組）和妊娠晚期睡眠剝奪組（LSD組）。采用輕輕觸摸法對實驗孕鼠每天進(jìn)行6個小時（12:00-18:00）的睡眠剝奪，持續(xù)一周時間，待其子代成年后（6-8周齡）進(jìn)行行為學(xué)檢測：1.用高架十字迷宮和新穎環(huán)境抑制攝食測試檢測子代大鼠的焦慮樣行為；2.用強迫游泳實驗檢測子代大鼠的抑郁狀態(tài)；3.用 Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　結(jié)果：高架十字迷宮實驗中，與對照組大鼠相比，經(jīng)歷

3、不同階段孕期睡眠剝奪后出生的大鼠，它們進(jìn)入開放臂的時間和次數(shù)都明顯減少；新穎環(huán)境抑制攝食測試結(jié)果顯示睡眠剝奪組大鼠與對照組相比，進(jìn)食的潛伏期顯著延長、攝食量明顯減少；這均說明孕期睡眠剝奪導(dǎo)致子代大鼠的焦慮樣行為；強迫游泳實驗發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪組所產(chǎn)的大鼠，它們的不動潛伏期和不動時間都顯著性縮短，而且以妊娠早期、晚期睡眠剝奪更明顯，表明孕期睡眠剝奪后出生大鼠表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為；Morris水迷宮實驗中，定位航行實驗顯示，孕期睡眠剝奪組所產(chǎn)大

4、鼠的平均逃離潛伏期比對照組較長，空間探索實驗顯示，孕期睡眠剝奪組所產(chǎn)大鼠與對照組相比，在目標(biāo)象限游泳的時間顯著減少，而各組大鼠的游泳速度無顯著差異。
　　結(jié)論：孕期不同階段的睡眠剝奪導(dǎo)致子代大鼠成年后情感障礙，產(chǎn)生焦慮、抑郁樣行為，并且損傷子代大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。
　　第二部分孕期睡眠剝奪對子代學(xué)習(xí)記憶影響機制探討
　　目的：進(jìn)一步研究孕期睡眠剝奪對子代學(xué)習(xí)記憶影響的可能機制，從海馬神經(jīng)發(fā)生、突觸可塑性兩方面探討其

5、機制。
　　方法：模型建立及分組同第一部分。免疫熒光實驗方法：
　　1.孕期睡眠剝奪組和對照組出生的大鼠滿2周時通過腹腔注射5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU，50mg/kg，每天一次），連續(xù)注射7天，4周后將大鼠麻醉，用生理鹽水和4％的多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流，然后取腦組織冰凍切片，運用免疫熒光實驗方法檢測海馬齒狀回區(qū)域神經(jīng)元存活的情況。用BrdU和NeuN（成熟神經(jīng)元特異性核蛋白標(biāo)志）抗體雙標(biāo)來檢測成熟神經(jīng)元的存活情況，用Brd

6、U和GFAP（星行膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志）抗體雙標(biāo)來檢測星行膠質(zhì)細(xì)胞的存活情況。
　　2.子代大鼠滿6周時給予腹腔注射BrdU（100mg/kg，每天一次）連續(xù)三天，24小時后將大鼠麻醉，用生理鹽水和4%的多聚甲醛進(jìn)行心臟灌流，然后取腦組織冰凍切片，用免疫熒光實驗方法檢測其海馬齒狀回區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞增殖情況。用DCX（雙皮質(zhì)素）抗體來檢測未成熟神經(jīng)元的變化，用BrdU和NeuN抗體雙標(biāo)來檢測成熟神經(jīng)元的增殖變化，用BrdU和GFAP抗體雙標(biāo)來

7、檢測星行膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。
　　電生理實驗方法：
　　1.在體電生理實驗：通過誘導(dǎo)大鼠海馬CA3-CA1通路的 LTP和 LTD，來檢測子代大鼠的突觸可塑性變化。LTP/LTD的大小是用高頻/低頻刺激之后的fEPSP的斜率與基線fEPSP的斜率進(jìn)行比較。
　　2.離體腦片膜片鉗實驗：成年大鼠海馬腦片制備：大鼠（6-8周齡)用30%的水合氯醛麻醉，心臟灌流氧飽和的NMDG人工腦脊液（NMDG ACSF），然后迅速取腦組

8、織進(jìn)行切片（400μm），腦片移入HEPES ACSF孵育槽里30℃孵育1小時后，轉(zhuǎn)入實驗記錄槽內(nèi)，采用離體腦片膜片鉗技術(shù)來檢測大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元微小興奮性突觸后電流（mEPSC）的頻率及幅度。
　　結(jié)果：免疫熒光實驗結(jié)果：
　　1.孕期不同階段睡眠剝奪后出生大鼠成年后其海馬齒狀回區(qū)域神經(jīng)元存活明顯減少。孕期SD組所產(chǎn)大鼠與對照組相比，BrdU/NeuN雙陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，而BrdU/GFAP雙陽性細(xì)胞數(shù)無明顯差異

9、。
　　2.孕期不同階段睡眠剝奪后出生大鼠成年后其海馬齒狀回區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞增殖減少。孕期SD組所產(chǎn)大鼠與對照組相比， BrdU和NeuN共表達(dá)的神經(jīng)細(xì)胞明顯減少，DCX陽性細(xì)胞與對照組相比顯著減少，而BrdU和GFAP共表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)無顯著差異。
　　電生理實驗結(jié)果：
　　1.在體電生理實驗：妊娠不同階段睡眠剝奪損傷子代大鼠海馬的LTP/LTD。與 CTR組相比，ESD、MSD、LSD組的LTP幅度顯著降低，而 L