孕期脂多糖暴露對(duì)子代大鼠尿鈉排泄及血管功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 孕期脂多糖暴露對(duì)子代大鼠腎臟多巴胺D1受體介導(dǎo)的尿鈉排泄的影響及機(jī)制研究
　　目的：
　　高血壓是心血管病重要危險(xiǎn)因素，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。既往認(rèn)為，基因與環(huán)境之間均在其中發(fā)揮了重要的作用。近年來(lái)，大量研究表明，孕期不良因素也是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要原因之一，并逐漸形成了“人類健康與疾病的發(fā)育起源”學(xué)說(shuō)。該學(xué)說(shuō)創(chuàng)始人David Barker及其同事認(rèn)為，如果胚胎在發(fā)育的關(guān)鍵階段遭

2、遇不良因素干擾將會(huì)對(duì)子代機(jī)體結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)影響。
　　母體感染與炎癥是孕期常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，孕期感染往往與一些出生后不良事件相關(guān)。宮內(nèi)感染已被認(rèn)為是胎兒不良因素的重要來(lái)源，LPS是格蘭陰性菌胞壁的重要成分，并且存在于人體消化道。通過(guò)腹腔注射LPS可以較好地模擬孕期感染模型。母體LPS暴露后可以導(dǎo)致機(jī)體、胎盤、羊水、胎兒等產(chǎn)生炎癥因子，IL-1，IL-6和TNF-α等，并影響胚胎發(fā)育。既往研究顯示，孕期LP

3、S暴露可引起子代血壓升高。眾所周知，血壓升高不僅僅是促高血壓因素增強(qiáng)的結(jié)果，抗高血壓因素功能降低也在其中發(fā)揮重要的作用，如:腎臟多巴胺能系統(tǒng)即是眾多的抗血壓作用因素之一。
　　腎臟可以產(chǎn)生多巴胺，并已被認(rèn)為是高血壓發(fā)生發(fā)展及血壓調(diào)控的重要因素。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能，多巴胺受體可以分成D1-(D1R，D5R)和D2-(D2R，D3R和D4R)兩大類共5種亞型。在機(jī)體鈉鹽負(fù)荷增加時(shí)，腎臟多巴胺可以通過(guò)D1類受體發(fā)揮顯著的促尿鈉排泄作用，并

4、保持血壓穩(wěn)定。在高血壓患者、鹽敏感性高血壓及遺傳性高血壓動(dòng)物模型常伴有多巴胺功能異常。之前的研究表明，腎臟D1R功能紊亂主要由其磷酸化水平升高導(dǎo)致，而后者則由腎臟GRK2、GRK4表達(dá)及活性升高引起。研究表明，氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致腎臟GRK2、GRK4表達(dá)及活性顯著升高。通過(guò)抗氧化劑TEMPOL干預(yù)，可以降低體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，恢復(fù)D1R磷酸化和表達(dá)水平，以及血壓。
　　因此，將探討孕期LPS暴露對(duì)子代大鼠腎臟多巴胺D1R介導(dǎo)的尿鈉排泄

5、功能的影響，以及通過(guò)抗氧化干預(yù)是否可以恢復(fù)D1R功能。
　　方法：
　　成年受孕SD大鼠在孕期第8，10，12天腹腔注射脂多糖注射液(0.79 mg/kg)，對(duì)照組注射等容積生理鹽水(0.5 ml)。子代大鼠出生后使用尾動(dòng)脈無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量法監(jiān)測(cè)血壓，并在第12周時(shí)分別給予抗氧化劑（TEMPOL，1.0 mmol/L飲水）干預(yù)3周。
　　分別檢測(cè)以下指標(biāo):
　　1.2.1子代大鼠出生后5周、3月、6月、9月、12月時(shí)

6、鼠尾血壓及兩組間血壓差值。
　　1.2.2分別用HE染色劑Masson三色法檢測(cè)腎臟形態(tài)學(xué)改變。
　　1.2.3檢測(cè)兩組大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下24小時(shí)尿量、總尿鈉排泄及血壓。
　　1.2.4子代大鼠氧化應(yīng)激檢測(cè)，尿液MDA，血漿SOD，腎臟SOD及GSH水平。
　　1.2.5子代大鼠腎臟多巴胺D1R介導(dǎo)的尿流速及尿鈉排泄率。
　　1.2.6子代大鼠腎臟GRK2，GRK4，D1R蛋白表達(dá)水平。
　　1.2.7子

7、代大鼠腎臟D1R磷酸化水平。
　　結(jié)果：
　　1.3.1孕期LPS暴露引起子代大鼠出生后血壓連續(xù)性升高。
　　1.3.2孕期LPS暴露引起子代大鼠基礎(chǔ)狀態(tài)下24小時(shí)總尿量及總尿鈉排泄降低。
　　1.3.3孕期LPS暴露導(dǎo)致子代大鼠腎臟D1R介導(dǎo)的尿鈉排泄功能受損，D1R蛋白表達(dá)降低，磷酸化升高。
　　1.3.4孕期LPS暴露子代大鼠腎臟D1R重要調(diào)節(jié)激酶GRK2、GRK4表達(dá)升高。
　　1.3.5 L

8、PS組子代大鼠腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)升高，如尿液丙二醛水平(MDA);抗氧化指標(biāo)降低，如血漿及腎臟超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量。
　　1.3.6通過(guò)抗氧化干預(yù)可以顯著改善氧化與抗氧化狀態(tài)，恢復(fù)GRK4、D1R蛋白表達(dá)，降低D1R磷酸化水平，并進(jìn)一步改善D1R介導(dǎo)的尿鈉排泄功能及血壓。
　　結(jié)論：
　　孕期脂多糖暴露可以通過(guò)ROS途徑導(dǎo)致子代大鼠腎臟GRK2、GRK4表達(dá)升高，進(jìn)一步導(dǎo)致D1R過(guò)度磷酸化及其

9、介導(dǎo)的尿鈉排泄功能障礙，最終導(dǎo)致血壓升高。
　　第二部分 孕期脂多糖暴露對(duì)子代大鼠腸系膜動(dòng)脈血管功能的影響及機(jī)制研究
　　目的：
　　之前的研究發(fā)現(xiàn)，孕期LPS暴露導(dǎo)致子代大鼠腎臟多巴胺受體D1R介導(dǎo)的尿鈉排泄功能受損。另外，有研究報(bào)道，孕期LPS暴露引起子代大鼠腎臟血管緊張素受體1型及2型比例(AT1R/AT2R)失衡，并通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）以及降低胸主動(dòng)脈縫隙連接蛋白37表達(dá)引起子代大鼠血管功能障

10、礙及血壓升高，但是對(duì)血管功能并無(wú)研究。由于胸主動(dòng)脈是容量血管，在血壓形成中發(fā)揮的作用較為有限，研究阻力血管功能，如腸系膜動(dòng)脈，對(duì)研究子代大鼠血壓形成具有重要意義。
　　大量研究表明，血管內(nèi)皮功能在血壓調(diào)節(jié)中具有重要作用，內(nèi)皮依賴性舒張功能降低是高血壓形成的重要原因。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放多種血管活性物質(zhì)，如:內(nèi)皮源性舒張因子NO。NO可通過(guò)彌散進(jìn)入平滑肌細(xì)胞，刺激鳥苷酸環(huán)化酶活性，導(dǎo)致cGMP含量增加，從而舒張血管。因此，腸系膜動(dòng)脈

11、NO-cGMP信號(hào)通路受損在高血壓發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
　　因此，研究主要探索孕期LPS暴露是否對(duì)子代大鼠腸系膜動(dòng)脈NO-cGMP通路造成影響及其可能的機(jī)制，并進(jìn)一步探索如何恢復(fù)受損的血管功能及降低血壓，為闡明胎兒程控性高血壓的發(fā)生機(jī)理提供指導(dǎo)。
　　方法：
　　成年受孕SD大鼠在孕期第8，10，12天腹腔注射脂多糖注射液(0.79 mg/kg)，對(duì)照組注射等容積生理鹽水(0.5 ml)，子代大鼠出生后使用尾動(dòng)脈無(wú)

12、創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)法每?jī)芍軝z測(cè)一次血壓，并在第15周時(shí)分別檢測(cè)基礎(chǔ)狀態(tài)下及給予抗氧化劑(TEMPOL，1mmol/L飲水)干預(yù)3周后子代大鼠血管功能。
　　分別檢測(cè)以下指標(biāo):
　　2.2.1腸系膜動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)改變。
　　1.2.2腸系膜動(dòng)脈基礎(chǔ)狀態(tài)下及孵育一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME(10-4 mol/L)或?yàn)踯账岘h(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ(10-5 mol/L)后對(duì)苯腎上腺素(phenylephrine，PE)介導(dǎo)的收縮

13、反應(yīng)性。
　　2.2.3腸系膜動(dòng)脈去內(nèi)皮前、后對(duì)PE介導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)性。
　　2.2.4腸系膜動(dòng)脈基礎(chǔ)狀態(tài)下及孵育一氧化氮合酶阻斷劑L-NAME(10-4 mol/L)或鳥苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ(10-5 mol/L)后對(duì)乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)介導(dǎo)的舒張反應(yīng)性。
　　2.2.5腸系膜動(dòng)脈去內(nèi)皮后對(duì)硝普鈉(SNP)介導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性血管舒張。
　　2.2.6腸系膜動(dòng)脈eNOS及GC

14、蛋白表達(dá)，完整血管內(nèi)皮下Ach刺激后NO生成反應(yīng)性以及去內(nèi)皮后SNP刺激下cGMP生成反應(yīng)性。
　　2.2.7腸系膜阻力動(dòng)脈超氧陰離子(DHE)水平及基礎(chǔ)狀態(tài)下AngⅡ含量。
　　2.2.8通過(guò)Western Blot檢測(cè)腸系膜動(dòng)脈eNOS、sGC、AT1R、NOX2、NOX4、nitrotyrosine、 SOD1和SOD2蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　2.3.1孕期脂多糖暴露組子代大鼠血壓自出生后第5周起顯

15、著高于對(duì)照組，并持續(xù)到觀察期第19周。
　　2.3.2孕期LPS暴露的子代大鼠出生后第15周時(shí)，其完整內(nèi)皮下由Ach介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能降低，PE介導(dǎo)的血管收縮功能增強(qiáng)。
　　2.3.3孕期LPS暴露的子代大鼠腸系膜血管內(nèi)皮去除后，由PE介導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈收縮較對(duì)照組顯著減弱。
　　2.3.4預(yù)先孵育一氧化氮合酶抑制劑L-NAME阻斷內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)活性劑或鳥苷酸環(huán)化酶(GC)抑制劑ODQ阻斷平滑肌細(xì)胞c

16、GMP合成，顯著減弱對(duì)照組子代大鼠Ach介導(dǎo)的舒張，增強(qiáng)PE介導(dǎo)的收縮，但在LPS子代大鼠無(wú)顯著變化。
　　2.3.5孕期LPS暴露的子代大鼠由SNP介導(dǎo)的內(nèi)皮非依賴性舒張功能明顯降低。
　　2.3.6孕期LPS暴露的子代大鼠血管eNOS、GC蛋白表達(dá)，NO、cGMP含量顯著降低，氧化應(yīng)激水平增加(DHE、AT1R、NOX2、NOX4、nitrotyrosine)，抗氧化能力降低(SOD1、SOD2)。
　　2.3.7

17、通過(guò)給予抗氧化劑TEMPOL干預(yù)3周，可以顯著恢復(fù)LPS子代大鼠體內(nèi)氧化失衡狀態(tài)，以及eNOS、GC蛋白表達(dá)和NO、cGMP含量;同時(shí)可以顯著恢復(fù)血管功能及血壓。
　　結(jié)論：
　　孕期脂多糖暴露可以導(dǎo)致子代大鼠出生后血壓升高，以及腸系膜血管NO-cGMP通路受損，導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性及非依賴性舒張功能障礙。另外，LPS子代大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激升高在血管功能障礙中發(fā)揮了重要作用。
　　全文結(jié)論：
　　孕期脂多糖暴露可以通過(guò)氧