DNA去甲基化對(duì)絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞特性和三胚層分化的影響.pdf

1、表觀遺傳標(biāo)記的變化是決定干細(xì)胞命運(yùn)和分化的重要調(diào)控因素。在過(guò)去的幾年里，表觀遺傳調(diào)控干細(xì)胞生物學(xué)的研究主要集中在胚胎干細(xì)胞(Embryonicstem cells，ESCs)。然而，對(duì)表觀遺傳調(diào)控成體干細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的理解卻很有限。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mensenchymal stem cells，MSCs)是研究最多的成體干細(xì)胞群體，但是對(duì)調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化狀態(tài)和特性的分子機(jī)制的研究仍不成熟。由于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose-der

2、ived stem cells，ADSCs)取材容易、來(lái)源廣泛，成為近些年理論研究和臨床應(yīng)用的首選材料。
　　本研究以特色優(yōu)質(zhì)阿爾巴斯絨山羊的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為研究對(duì)象，使用表觀遺傳試劑氮胞苷(5-azacytidine，5-Aza)和地西他濱（5-aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-dC）體外改變脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表觀遺傳修飾，研究DNA去甲基化對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的特性和功能的調(diào)控作用，以便豐富表觀遺傳調(diào)控干

3、細(xì)胞分化的內(nèi)容，為理解干細(xì)胞特性和功能的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　一、表觀遺傳試劑對(duì)阿爾巴斯絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
　　本研究通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法和流式細(xì)胞周期和凋亡檢測(cè)的結(jié)合發(fā)現(xiàn)，以半抑制濃度培養(yǎng)細(xì)胞24h時(shí)，雖然細(xì)胞周期阻斷在G0/G1期，但細(xì)胞凋亡數(shù)目較少，活性最強(qiáng)。
　　二、表觀遺傳試劑對(duì)阿爾巴斯絨山羊脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞去甲基化作用
　　我們使用半抑制濃度的5-Aza和5-Aza-dC分別培

4、養(yǎng)細(xì)胞24h，提取5-Aza和5-Aza-dC處理后的gADSCs基因組，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平降低，然而羥甲基化水平升高。5-Aza和5-Aza-dC對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響是一致的，都引起DNMT1和DNMT3B基因轉(zhuǎn)錄抑制，DNMT3A、TET1、TET2和TET3基因轉(zhuǎn)錄升高。蛋白質(zhì)水平上，gADSCs在5-Aza處理下，DNMT1表達(dá)量下降，TET1和TET3表達(dá)升高;5-Aza-dC處理后，雖然沒有抑制DNMT1表達(dá)，但是TE

5、T1、TET2和TET3蛋白表達(dá)升高。結(jié)果表明，雖然5-Aza和5-Aza-dC的作用機(jī)制略有不同，但是都引起了TET家族促進(jìn)5-甲基胞嘧啶向5-羥甲基胞嘧啶發(fā)生轉(zhuǎn)換，基因組DNA發(fā)生很大程度的去甲基化。
　　三、DNA去甲基化對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　細(xì)胞免疫熒光、實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)5-Aza和5-Aza-dC處理前后的gADSCs中，增殖相關(guān)基因TERT和PCNA，凋亡相關(guān)基因P53

6、和BAX和多能性相關(guān)基因Nanog、 Oct4和Sox2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的情況。研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza和5-Aza-dC處理后的細(xì)胞中，Oct4、Sox2、TERT、PCNA和P53的轉(zhuǎn)錄水平均降低;在5-Aza處理后的細(xì)胞中，Nanog的轉(zhuǎn)錄水平升高，BAX的轉(zhuǎn)錄水平降低;在5-Aza-dC處理后的細(xì)胞中，Nanog的轉(zhuǎn)錄水平降低，BAX的轉(zhuǎn)錄水平升高。進(jìn)一步地，5-Aza和5-Aza-dC處理提高了Sox2的表達(dá)，降低了PCNA的表達(dá)，而

7、BAX的表達(dá)升高。Nanog、Oct4、TERT和P53基因表達(dá)沒有變化。結(jié)果表明，基因組去甲基化改變了增殖、凋亡和多能性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。干細(xì)胞多能性的提高依賴于Sox2表達(dá)提高。
　　四、DNA去甲基化對(duì)gADSCs向三胚層分化的影響
　　通過(guò)檢測(cè)處理前后誘導(dǎo)形成的脂肪細(xì)胞分泌的脂滴含量和脂肪細(xì)胞特異性因子PPARG、Adipod、Fabp4和Leptin轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)處理后脂肪細(xì)胞的脂滴產(chǎn)量增加，PPARG轉(zhuǎn)錄水平降

8、低，Adipod、Fabp4和Leptin轉(zhuǎn)錄水平升高。ELISA檢測(cè)5-Aza和5-Aza-dC處理前后gADSCs分化形成的神經(jīng)細(xì)胞中NGF含量，發(fā)現(xiàn)其含量增加。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，處理后分化的神經(jīng)細(xì)胞中ENO2和RBFOX3轉(zhuǎn)錄水平升高。通過(guò)檢測(cè)5-Aza和5-Aza-dC處理前后gADSCs分化形成的肝臟細(xì)胞中ALB和尿素含量、AFP轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)處理后ALB和尿素含量增加、AFP轉(zhuǎn)錄水平升高。這些結(jié)果表明，5-Aza和5-

9、Aza-dC處理促進(jìn)了gADSCs向脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肝臟細(xì)胞分化。
　　五、DNA去甲基化對(duì)PPARG、RBFOX3和HNF4A啟動(dòng)子甲基化水平的影響
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分化前5-Aza和5-Aza-dC改變了脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝臟細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PPARG、RBOXF3和HNF4A的轉(zhuǎn)錄水平。亞硫酸氫鹽測(cè)序檢測(cè)PPARG、RBOXF3和HNF4A啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平發(fā)生改變。PPARG啟動(dòng)子區(qū)域第8

10、1位CpG去甲基化位點(diǎn)、RBFOX3啟動(dòng)子區(qū)域第8、20、44、70、174和181位CpG甲基化位點(diǎn)和HNF4A啟動(dòng)子區(qū)域的4個(gè)CpG去甲基化位點(diǎn)對(duì)PPARG、RBFOX3和HNF4A的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有重要作用。
　　綜上研究得出，5-Aza和5-Aza-dC引起TET家族高表達(dá)促進(jìn)5-甲基胞嘧啶向5-羥甲基胞嘧啶發(fā)生轉(zhuǎn)換，基因組DNA發(fā)生去甲基化;去甲基化使得不同基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生改變，但是卻依賴Sox2基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)gADSC