甘草酸與甘草次酸對體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、成骨分化和基因組DNA甲基化的影響.pdf

1、[目的]
　　前期研究已發(fā)現(xiàn)甘草酸具有預防小鼠骨質(zhì)疏松的作用，但其作用機制尚不明確。甘草酸與甘草次酸存在顯著的體內(nèi)藥代動力學差異，傳統(tǒng)認為甘草酸的體內(nèi)代謝產(chǎn)物甘草次酸是發(fā)揮藥理作用的主要成分。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞探討甘草酸與甘草次酸抗骨質(zhì)疏松的作用機制，同時觀察這兩者是否存在藥效學差異。實驗通過檢測細胞增殖活性、細胞周期分析、堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)形成、鈣磷沉積量、基因表達水平和基因組DNA甲基化水平等指標，

2、評價甘草酸與甘草次酸對體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖、成骨分化的影響并探討相關(guān)作用機制，為進一步研究甘草防治骨質(zhì)疏松新用途提供科學依據(jù)。
　　[方法]
　　1.采用全骨髓貼壁法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)，倒置相差顯微鏡觀察原代和傳代培養(yǎng)細胞形態(tài)特征和生長情況，取生長狀態(tài)良好的第四代細胞用流式細胞儀免疫熒光雙標記法檢測細胞表面抗原，并用堿性磷酸酶

3、染色和茜素紅染色判斷BMSCs能否向成骨細胞方向分化。
　　2.標準培養(yǎng)條件下，將骨髓間充質(zhì)干細胞分為空白組（BLANK）、甘草酸組(Ga10-8、Ga10-7、Ga10-6)、甘草次酸組（Gca10-8、Gca10-7、Gca10-6），采用MTT法檢測細胞增殖活性，流式細胞PI染色法進行細胞周期分析，PNPP法檢測細胞堿性磷酸酶活性。
　　3.成骨誘導培養(yǎng)條件下，將骨髓間充質(zhì)干細胞分為空白組(B LANK)、成骨誘導組(

4、OB)、成骨誘導+甘草酸組（OB+Ga10-8、OB+Ga10-7、OB+Ga10-6）、成骨誘導+甘草次酸組(OB+Gca10-8、OB+Gca10-7、OB+Gca10-6)，檢測細胞增殖活性和堿性磷酸酶活性，礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色并進行染色面積半定量分析，ICP法測定細胞鈣磷沉積量，RT-PCR方法檢測Dickkopf-3、β-catenin、Runx2和 OPG mRNA表達。
　　4.收集新鮮分離的骨髓細胞、P0～P4代BM

5、SCs、空白組(BLANK)、成骨誘導組(OB)、成骨誘導+甘草酸組(OB+Ga10-8、OB+Ga10-7、OB+Ga10-6)、成骨誘導+甘草次酸組（OB+Gca10-8、OB+Gca10-7、OB+Gca10-6）細胞，提取基因組DNA，甲酸水解DNA后用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測基因組DNA甲基化水平。
　　[結(jié)果]
　　1.通過全骨髓貼壁法分離純化得到形態(tài)較為均一的骨髓間充質(zhì)干細胞，P4代BMSCs細胞表面抗原表達CD2

6、9+、CD90+（陽性率＞97％），CD45-(陽性率為0.3％)，成骨誘導培養(yǎng)BMSCs表達堿性磷酸酶并可形成礦化結(jié)節(jié)。
　　2.標準培養(yǎng)條件下，甘草酸與甘草次酸對BMSCs增殖活性無明顯影響，僅在48h出現(xiàn)短暫的抑制作用;細胞周期分析顯示低、中濃度甘草酸與甘草次酸組具有促進BMSCs增殖的作用，而高濃度甘草酸與甘草次酸具有抑制細胞增殖的作用;各組細胞堿性磷酸酶(ALP)活性呈時間依賴性升高，第3、7天各組ALP活性無顯著差異，

7、第11、15天甘草酸與甘草次酸組ALP活性高于空白組，但差異無統(tǒng)計學意義。
　　3.在成骨誘導培養(yǎng)條件下，甘草酸與甘草次酸對細胞增殖活性和堿性磷酸酶活性無明顯影響，僅第8天低、中濃度甘草酸有升高ALP活性的作用;甘草酸促進細胞礦化結(jié)節(jié)形成，而甘草次酸對細胞礦化結(jié)節(jié)形成無顯著影響;低濃度甘草酸與高濃度甘草次酸組細胞鈣、磷沉積量升高，而中濃度甘草酸和低濃度甘草次酸起相反作用，低濃度甘草酸使細胞鈣磷比值最接近羥基磷灰石理論鈣磷比值;甘草

8、酸上調(diào)β-catenin、Runx2和OPG mRNA表達，下調(diào)Dickkopf-3 mRNA表達，而甘草次酸則下調(diào)β-catenin、Runx2和OPG mRNA表達，不影響Dickkopf-3mRNA表達。
　　4.P0至P4代BMSCs基因組DNA甲基化水平與細胞純度呈中等程度相關(guān)，BMSCs基因組DNA水平明顯低于骨髓細胞。
　　5.P4代BMSCs標準培養(yǎng)和成骨誘導培養(yǎng)0、6、12天，基因組DNA水平變化均呈現(xiàn)先升

9、高后降低的趨勢，甘草酸與甘草次酸顯著降低成骨誘導培養(yǎng)BMSCs基因組DNA甲基化水平。
　　[結(jié)論]
　　1.采用全骨髓貼壁法可獲得到純度較高、生物學性狀穩(wěn)定的BMSCs，可為后續(xù)實驗提供合格的細胞來源。
　　2.甘草酸與甘草次酸對細胞增殖活性、細胞周期分布影響不大，從堿性磷酸酶活性、礦化結(jié)節(jié)形成、鈣磷沉積量和基因表達調(diào)控等評價成骨分化指標，對比分析甘草酸與甘草次酸進行藥效學和作用機制的差異，表明甘草酸能促進BMSCs

10、向成骨細胞方向分化，而甘草次酸則起抑制作用，甘草酸為體外促進BMSCs成骨分化的活性成分。
　　3.體外傳代培養(yǎng)BMSCs具有基因組低甲基化模式的特點，基因組DNA甲基化水平檢測可作為BMSCs的輔助鑒定手段?；蚪MDNA甲基化調(diào)控BMSCs成骨分化具有階段性、雙向性、動態(tài)且適度等特點。甘草酸與甘草次酸均可降低成骨誘導培養(yǎng)BMSCs基因組DNA甲基化水平，甘草酸可能通過適度降低基因組DNA甲基化起促進骨髓間充質(zhì)成骨分化的作用，甘草