人骨髓間充質(zhì)干細胞轉分化為汗腺樣細胞的DNA甲基化調(diào)控機制.pdf

1、目的:
　　(1)優(yōu)化人外分泌汗腺細胞（sweat gland cells，SGCs）的分離方法，以高效地獲取原代汗腺細胞。
　　(2)建立體外誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-MSCs）向汗腺樣細胞分化的共培養(yǎng)體系，并觀察誘導后細胞形態(tài)、表型和相關基因表達的改變。
　　(3)探討DNA甲基化在BM-MSCs向汗腺樣細胞轉分化過程中的調(diào)控作用，并尋找甲基化調(diào)控的靶點基因。
　　方法：
　?。?）取新鮮的全皮層組

2、織，剪成小塊微粒，分別用不同的方法（胰酶+膠原酶，單純胰酶，單純膠原酶）消化分離汗腺，觀察消化過程中出現(xiàn)游離汗腺的時間；微量移液器挑取游離汗腺，進行體外培養(yǎng)，觀察細胞的貼壁情況和生長狀態(tài)；9天后，流式細胞儀檢測存活下來的細胞的增殖能力，并利用免疫細胞化學檢測汗腺細胞的表面抗原CK7和CEA的表達狀況。
　?。?）購買骨髓間充質(zhì)干細胞系，體外培養(yǎng)、擴增，并進行細胞的成脂肪、成骨細胞分化能力的鑒定；選取第三代的BM-MSCs與熱休克后

3、汗腺細胞（47℃）進行 Transwell+誘導因子的共培養(yǎng)，分別于第3、6、9天觀察細胞形態(tài)學的變化，設置汗腺細胞為陽性對照組。細胞免疫熒光技術檢測細胞汗腺表面抗原CK7和CEA的表達，RT-PCR和Western blot分別檢測CK7、CEA在mRNA水平和蛋白水平的表達變化。
　?。?）采用Illumina450K甲基化芯片檢測轉分化前后細胞的甲基化水平的變化，篩選甲基化差異性基因，隨后對差異基因進行生物信息學分析（差異位

4、點篩選、聚類層次分析、Gene Ontology、KEGGPathway分析、生物學功能注釋、蛋白-蛋白相互作用）；結合預實驗結果和相關文獻，對若干候選基因(HDAC4、PAX6、MMP1、EDA等)，用甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR，MSP)進行初步驗證，然后通過Mass Array飛行質(zhì)譜技術對特定基因位點進行重點分析；最后，構建特定基因的重組質(zhì)粒，體外轉染 BM-MSCs，觀察質(zhì)粒轉染后細胞表

5、型和相關基因的表達情況。
　　結果：
　?。?）酶聯(lián)合消化法(A組)在2h時，鏡下可見較多游離的汗腺細胞；胰蛋白酶-EDTA法（C組）獲取的細胞貼壁很差；膠原酶法（B組）在6h左右時，才有較多的游離汗腺出現(xiàn)。A組和B組獲取后的汗腺細胞貼壁良好，生長增殖正常,流式檢測結果顯示：A組和B組細胞的增殖指數(shù)分別為(18±4)％和(17±6)%，無統(tǒng)計學差異。免疫細胞化學表型鑒定結果顯示：酶聯(lián)合消化組和膠原酶組獲取的細胞CEA、CK7

6、陽性率未見明顯差異。
　?。?）通過多向分化潛能實驗，我們證實 BM-MSCs可以分化為脂肪細胞和骨細胞。Transwell+誘導因子共培養(yǎng)3天時，BM-MSCs的細胞形態(tài)基本沒有變化，仍呈長梭形；共培養(yǎng)9d后，細胞形態(tài)呈多樣化，部分細胞出現(xiàn)近似于汗腺樣細胞的改變，由誘導前的長梭形變?yōu)楸馄讲灰?guī)則狀，并且逐步聚集呈向心性生長。對汗腺樣細胞進行細胞免疫熒光、RT-PCR和Western blot檢測，都發(fā)現(xiàn)其不同程度地表達汗腺細胞表面

7、抗原CK7、CEA。
　?。?）采用 Illumina甲基化芯片，在全基因組范圍內(nèi)初步篩選出甲基化水平明顯差異的探針位點693個；甲基化差異性基因有437個基因（升高97個，下降350個）；差異位點區(qū)域分布顯示：主要分布在N_Shore和CpG islands區(qū)域，基因區(qū)域分布主要集中在Genebody和TSS200區(qū)域。Gene Ontology和KEGG pathway分析顯示：主要涉及細胞命運界定、信號轉導與基因表達、轉錄阻

8、遏、外胚層發(fā)育等生物學過程。MSP和Mass Array飛行質(zhì)譜結果顯示：與誘導前BM-MSC相比，誘導后汗腺樣細胞中HDAC4的甲基化水平明顯下調(diào)，與甲基化芯片結果大體一致。轉染 HDAC4質(zhì)粒載體后，免疫細胞化學和 RT-PCR結果都顯示CEA表達明顯上調(diào)。
　　結論：
　?。?）胰蛋白酶和膠原酶聯(lián)合應用能明顯縮短汗腺細胞的分離時間，且不影響細胞的增殖活性和抗原表達情況。
　?。?） BM-MSCs和熱休克汗腺間接