rAAV2-GPⅡb-GPⅢa載體構(gòu)建和體外表達(dá)、功能實(shí)驗(yàn).pdf

1、血小板無(wú)力癥是一種常染色體隱性遺傳病。由于患者基因缺陷導(dǎo)致血小板膜表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa復(fù)合物(GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物)表達(dá)量或質(zhì)的異常，血小板對(duì)多種生理性激動(dòng)劑如ADP、腎上腺素、膠原和凝血酶先天性無(wú)聚集反應(yīng)或反應(yīng)減低，血小板在Ⅱ期生理止血過(guò)程中不能有效地聚集形成血小板栓而導(dǎo)致出血。主要表現(xiàn)為自幼出現(xiàn)的程度不一的出血癥狀，可表現(xiàn)為皮膚瘀斑、鼻出血、月經(jīng)過(guò)多，直至致命的大出血。目前此病尚無(wú)有效常規(guī)治療方法，而長(zhǎng)期輸注血小板又可引起輸注耐受。

2、 利用基因治療載體將治療基因?qū)牖颊咴煅杉?xì)胞，對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體外基因修飾后再回輸體內(nèi)是目前血小板無(wú)力癥基因治療的研究方向之一?；蛑委熆稍谝欢ǔ潭壬霞m正基因缺陷，甚至達(dá)到根治目的。 選擇一種安全、高效的基因轉(zhuǎn)移載體是基因治療成功的關(guān)鍵之一。1999年WilCOX等應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開始了對(duì)血小板無(wú)力癥進(jìn)行體外修飾基因治療的相關(guān)研究，但由于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體本身的安全性問(wèn)題限制了它的使用，因此需要尋求其他可能的載體。2型腺相關(guān)

3、病毒(AAV-2)因具有與人類疾病無(wú)相關(guān)性、宿主范圍廣、可介導(dǎo)外源基因長(zhǎng)期表達(dá)等特點(diǎn)，在既往研究中發(fā)現(xiàn)AAV-2對(duì)造血干細(xì)胞也具有一定的感染效率，因此選用rAAV-2作為治療載體，研究rAAV-2介導(dǎo)GP Ⅱb/Ⅲa基因在體外真核細(xì)胞株中的表達(dá)情況以及相關(guān)功能研究。 本研究與國(guó)家863病毒載體研發(fā)基地合作。以基地提供的通用腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pSNAV-Ⅰ為基礎(chǔ),構(gòu)建成以CMV為啟動(dòng)子,分別含有GP Ⅱ b和GPⅢa基因的2種重組

4、質(zhì)粒。通過(guò)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞,經(jīng)G418選擇培養(yǎng),分別得到包裝病毒用的載體紐胞株。再用rAAV2的包裝輔助病毒感染載體細(xì)胞株,細(xì)胞病變完全后行細(xì)胞裂解、酚氯仿抽提、純化后得到2種攜帶GPⅡb和GPⅢa基因的重組AAV病毒。經(jīng)PCR、HPLC、電鏡等多種方法檢測(cè),證明所構(gòu)建的這2種重組AAV病毒構(gòu)建正確,純度好。并通過(guò)點(diǎn)雜交的方法測(cè)定病毒滴度。 本研究采用多種方法,從不同水平檢測(cè)了rAAV2介導(dǎo)的GP Ⅱ b/Ⅲa在體外真核細(xì)胞

5、株(BHK-21)的表達(dá),并且同時(shí)分析了不同感染劑量與GP Ⅱ b和GPⅢa基因表達(dá)量之間的關(guān)系。并且通過(guò)PAC-I實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)所表達(dá)的GP Ⅱ b和GPⅢa蛋白的功能。結(jié)果表明:在MOI為1×10<'5>的條件下,感染24小時(shí)后即可在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)到GP Ⅱ b和GPⅢa基因的表達(dá);48小時(shí)可在蛋白水平檢測(cè)到GPⅡb和GPⅢa基因表達(dá),感染48小時(shí)后免疫熒光亦可在BHK-21細(xì)胞表面檢測(cè)所表達(dá)目的基因產(chǎn)物。在量效研究中發(fā)現(xiàn),在一定劑量范圍內(nèi)

6、GP Ⅱ b和GPⅢa,蛋白表達(dá)量隨著MOI的升高而增加,但由于rAAV受體競(jìng)爭(zhēng)性抑制的存在,過(guò)高的MOI反而是表達(dá)量下降。PAC-Ⅰ結(jié)合結(jié)果表明目的基因表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ADP活化后能與PAC-Ⅰ結(jié)合,具有正常的生物學(xué)活性。 本研究表明:rAAV2載體能夠有效的介導(dǎo)GP Ⅱ b和GPⅢa基因在體外細(xì)胞株中的表達(dá),并且所表達(dá)產(chǎn)物具有正常的生物學(xué)活性。為重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)血小板無(wú)力基因治療的下一步研究打下了良好的工作基礎(chǔ)，為目前病毒載