光敏劑-納米粒載體系統(tǒng)在卵巢癌光動(dòng)力學(xué)治療中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[研究背景與目的] 卵巢癌發(fā)病率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第三位，死亡率居首位。由于缺乏有效的早期篩查手段，70％的卵巢癌患者就診時(shí)已屆晚期。近年來(lái)，盡管卵巢癌手術(shù)技巧不斷提高，新型化療藥物、化療方案亦陸續(xù)投入臨床使用，但這些傳統(tǒng)的治療手段均未能顯著改善患者長(zhǎng)期生存率，70％的晚期卵巢癌患者最終將復(fù)發(fā)并死于癌癥。復(fù)發(fā)性卵巢癌治療原則是姑息性治療，手術(shù)與化療作為主要治療手段，其治療價(jià)值尚未得到肯定。光動(dòng)力學(xué)治療(photodynam

2、ic therapy，PDT)作為一種新的高選擇性腫瘤治療方法，臨床上已成功應(yīng)用于食管癌、肺癌等惡性腫瘤晚期、復(fù)發(fā)性患者的姑息性治療，取得了一定的療效。對(duì)于晚期或復(fù)發(fā)性卵巢癌患者，在給予光敏劑后，于手術(shù)過(guò)程中開腹或通過(guò)腹腔鏡將光源導(dǎo)入腹腔，對(duì)術(shù)后殘存的微小病灶進(jìn)行彌漫性照射，或者對(duì)大的孤立性病灶行局部照射，即行腹腔光動(dòng)力學(xué)治療(intraperitonneal photodynamic therapy，TPPDT)，可以成為晚期或復(fù)發(fā)性

3、卵巢癌患者新的輔助治療或姑息性治療手段。 近年來(lái)隨著納米科技的飛速發(fā)展，納米藥物的研究成為藥物研究中一個(gè)很有生命力的新方向。將藥物制備成納米級(jí)顆?；蛘呤褂眉{米載體攜帶藥物，可以使藥物具備新的特別的性質(zhì)，如改善藥物的溶解性、增強(qiáng)藥物的靶向性、緩釋性、可控性、智能性以及降低毒性等。本研究中，我們以國(guó)產(chǎn)二代光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)、竹紅菌素B(HB)為原料藥物，采用乳化聚合一二步法制備成功了HMME(HB)-聚氰基丙烯酸正丁酯納

4、米粒載體系統(tǒng)，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化處方與制備工藝。使用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)測(cè)定納米粒載體系統(tǒng)攜帶藥物經(jīng)腹腔注射后在荷瘤Fischer 344大鼠以及家兔體內(nèi)各臟器藥物分布以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證了納米載體的緩釋、長(zhǎng)效以及淋巴靶向等特性。通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了：HMME/HB對(duì)卵巢癌細(xì)胞以及動(dòng)物體內(nèi)移植瘤的PDT效應(yīng)，同時(shí)對(duì)光敏劑在細(xì)胞內(nèi)亞細(xì)胞器定位、PDT誘導(dǎo)線粒體相關(guān)調(diào)亡以及調(diào)亡相關(guān)蛋白的表達(dá)在分子生物學(xué)水平進(jìn)行了研究。

5、 第一章竹紅菌乙素一聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)的研制及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)研究 [目的] 研制聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)，攜帶光敏劑竹紅菌素B用于卵巢癌光動(dòng)力學(xué)治療。 [材料與方法] 1、以聚氰基丙烯酸正丁酯(Poly butyl cyanoacrylate,PBCA)為納米粒載體材料，采用乳化聚合一二步法制備竹紅菌乙素一聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)(HB-PBCA-NP)，均勻設(shè)

6、計(jì)優(yōu)化處方與制備工藝，電子顯微鏡、激光散射粒度分析儀、紫外分光光度法進(jìn)行形態(tài)、粒徑、分布、載藥量、包封率研究。 2、體外培養(yǎng)大鼠低分化上皮性卵巢癌細(xì)胞株NuTu—19，收集細(xì)胞后接種Fischer344大鼠腹腔，建立卵巢癌腹水瘤模型。相同劑量(10mg/Kg)HB-PBCA-NP與HB-DMSO(對(duì)照組)經(jīng)大鼠腹腔注射后，于不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，取腹腔臟器、腫瘤組織和血清標(biāo)本，提取組織中藥物，行HPLC分析其藥物代謝動(dòng)力學(xué)以及藥物

7、組織分布特點(diǎn)。 3、建立相同動(dòng)物模型，行腹腔PDT治療。動(dòng)物隨機(jī)分為4組：組A未接受任何治療，僅隨訪觀察；組B接受腹腔腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)；組C術(shù)后接受HB-DMSO-PDT治療；組D術(shù)后接受HB-PBCA-NP-PDT治療。PDT組藥物劑量均為10 mg/Kg，激光光照劑量50 J/cm2。PDT后觀察動(dòng)物生存率，與對(duì)照組比較確定PDT對(duì)大鼠卵巢癌腹水瘤模型的療效。 [結(jié)果] 1、HB-PBCA-NP最佳優(yōu)化處方

8、與工藝為：PBCA用量為0.07ml，乳化劑P1uronicF-127用量為58mg，穩(wěn)定劑Dextran-70用量為22mg，pH值為1.5，攪拌時(shí)間為4h。根據(jù)優(yōu)化工藝制得三批HB-PBCA-NP，電子透射顯微鏡下為圓整均勻的球形顆粒，無(wú)粘連。激光散射粒度分析儀測(cè)得毫微粒平均粒徑為72 nm，分布范圍30～300nm，載藥量為15％，包封率為92.7％。建立紫外分光光度法質(zhì)量控制方法與標(biāo)準(zhǔn)，在20～70μg/ml范圍內(nèi)以濃度對(duì)吸光

9、度進(jìn)行線性回歸，得線性方程為y=0.010537x+0.063162(r=0.9993)，日內(nèi)與日間精密度RSD分別為1.12％、1.46％，平均回收率為99.7％。 2、建立了高效液相色譜法測(cè)定HB血藥濃度及在體內(nèi)各組織分布的方法，生物樣品預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，在所選色譜條件下，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾HB的測(cè)定，回收率高，重現(xiàn)性好。荷瘤大鼠組織器官分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HB-DMSO消除半衰期(t<,1/2>)為9.449h，HB-PBCA-N

10、P消除t<,1/2>為12.944h。 3、手術(shù)后HB-DMSO-PDT、、HB-PBCA-NP-PDT組大鼠生存率分別為31.1％和33.3％，中位生存時(shí)間分別為95天(95％CI 86.68～103.316天)和99天(95％CI 90.24～107.74天)，兩組生存時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.293)?？瞻讓?duì)照組組與單純手術(shù)組中位生存時(shí)間分別為76(95％CI 69.8～82.2天)和84天(95％CI 81.08～86

11、.92天)(P<0.05)。與對(duì)照組比較，手術(shù)以及手術(shù)后PDT均能夠延長(zhǎng)大鼠生存時(shí)間，術(shù)后PDT與單純手術(shù)比較亦能夠延長(zhǎng)大鼠生存時(shí)間(P均小于0.05)。 [結(jié)論] 本研究成功制備了HB-PBCA-NP載體系統(tǒng)，HB制成納米粒后具有緩釋長(zhǎng)效作用，半衰期顯著延長(zhǎng)；HB-PBCA-NP、HB-DMSO腹腔給藥后PDT均可顯著延長(zhǎng)Fisecher344大鼠腹水瘤模型的生存期。 第二章 血卟啉單甲醚一聚氰基丙烯酸正丁酯

12、納米粒載體系統(tǒng)的研制及其淋巴靶向性研究 [目的] 制備血卟啉單甲醚一聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)，驗(yàn)證其在家兔體內(nèi)的淋巴靶向性 [材料與方法]1、建立血卟啉單甲醚原料藥的高效液相色譜分析方法，使用與PART 1.1相同的方法建立血卟啉單甲醚—聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒載體系統(tǒng)(HMME-PBCA-NP)，并進(jìn)行處方、工藝優(yōu)化。 2、家兔腹腔注射相同劑量HMME-PBCA-NP與HMME注射液(15m

13、g/Kg)，不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物后取腹腔臟器與腹腔淋巴組織，行HPLC分析比較HMME-PBCA-NP與HMME注射液在腹腔淋巴結(jié)中的分布。 [結(jié)果] 1、HMME-PBCA-NP最佳優(yōu)化處方與工藝為：PBCA用量為0.07ml，乳化劑PluronicF-127用量為68mg，穩(wěn)定劑Dextran-70用量為79mg，HMME用量2mg，pH值為1.5，攪拌時(shí)間為4h。根據(jù)優(yōu)化工藝制得三批HB-PBCA-NP，電子透射顯

14、微鏡下為圓整均勻的球形顆粒，無(wú)粘連。激光散射粒度分析儀測(cè)得毫微粒平均粒徑為167nm，包封率為91.2％，載藥量為23％。 2、腹腔給藥1、3、6、12、24h后HMME-PBCA-NP組腹腔淋巴結(jié)藥物濃度分別為0.56±0.03、0.8±0.02、0.35±0.01、0.22±0.005、0.16±0.01μg/g，而對(duì)照組分別為0.13±0.005、0.16±0.004、0.13±0.002、0.1±0.001、0.09±0

15、.00 μg/g。HMME-PBCA-NP腹腔給藥后家兔腹腔淋巴結(jié)中藥物濃度顯著高于對(duì)照組HMME注射液(P<0.05)。 [結(jié)論] 本研究成功制備了HMME-PBCA-NP載體系統(tǒng)，經(jīng)腹腔注射后納米?？蓴y帶藥物選擇性的進(jìn)入腹腔淋巴組織，具有一定程度的淋巴靶向性。 第三章 竹紅菌素B、血卟啉單甲醚對(duì)卵巢癌細(xì)胞光毒性的體外實(shí)驗(yàn)研究 [目的] 探討血卟啉單甲醚、竹紅菌乙素在卵巢癌細(xì)胞系NuTu—1

16、9中的分布特點(diǎn)以及其體外光毒性。 [材料與方法] NuTu—19腫瘤細(xì)胞與光敏劑(HB，30 μ g/ml；HMME，60 μ g/ml)、亞細(xì)胞器探針(RHl23，lOug/ml；Lucifer Yellow，120ug/m1)共同孵育后，熒光顯微鏡下以特定激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)光敏劑與熒光探針，觀察光敏劑細(xì)胞內(nèi)定位；MTT比色法測(cè)定不同劑量藥物(HMME/I-HB，0～20ug/m1)和激光劑量(O～6J/cm<'2>)配伍組

17、PDT后NuTu-19細(xì)胞的存活率；HMME-PDT/HB-PDT后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞死亡形式，線粒體相關(guān)調(diào)亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)線粒體破壞情況。 [結(jié)果] HMME與HB在細(xì)胞內(nèi)均呈現(xiàn)紅色熒光，RH-123、Lucifer Yellow單獨(dú)染色后細(xì)胞漿內(nèi)均可見(jiàn)綠色點(diǎn)狀熒光；HB與RH-123、Lucifer Yellow共同孵育后細(xì)胞漿內(nèi)均可見(jiàn)黃色共同染色區(qū)域；而H刪E與RH-123共同孵育后，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)黃色共同染色

18、區(qū)域，HMME與Lucifer Yellow共同孵育后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)黃色共同染色區(qū)域。單純激光照射，無(wú)論光照強(qiáng)度大小對(duì)細(xì)胞存活率均無(wú)影響(P>0.05)；單純光敏劑(HMME/HB)作用于細(xì)胞，無(wú)論藥物劑量大小(O～20ug/m1)細(xì)胞生存率亦不受影響(p>0.05)；當(dāng)光敏劑與光照同時(shí)作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞生存率隨光照劑量和藥物劑量的增加而逐漸降低，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系曲線。不同激光照射組間細(xì)胞生存率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.004)，不同藥物濃

19、度組間細(xì)胞生存率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.001)。Annexin V/PI雙染色流式細(xì)胞儀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)HB-PDT、HMME-PDT。處理后4h、8h死亡細(xì)胞均以壞死細(xì)胞為主，調(diào)亡細(xì)胞所占比例均不超過(guò)2％。HB-PDT/HMME-PDT。后細(xì)胞內(nèi)線粒體均被破壞，線粒體陰性率達(dá)100％。 [結(jié)論] HB可定位于NuTu-19細(xì)胞溶酶體和線粒體上，HMME在細(xì)胞線粒體上無(wú)分布；HB-PDT/HMME-PDT對(duì)NuTu-19具

20、有體外光毒性，盡管其均可破壞細(xì)胞線粒體，其殺傷細(xì)胞方式主要為壞死而非調(diào)亡。 第四章 血卟啉單甲醚對(duì)卵巢癌光動(dòng)力學(xué)治療的體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)研究 [目的] 探討血卟啉單甲醚對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及其裸鼠皮下移植瘤的光動(dòng)力學(xué)治療療效 [材料與方法] 分光光度計(jì)、熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)HMME吸收光譜以及其在細(xì)胞內(nèi)的熒光分布；MTT比色法測(cè)定不同劑量藥物和激光配伍組SKOV3細(xì)胞的存

21、活率；Annexin V/PI雙染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞死亡機(jī)制；建立裸鼠皮下移植瘤模型，觀察}tMME-PDT(10 mg/Kg，120 J/cm<'2>)對(duì)實(shí)體腫瘤的治療作用。 [結(jié)果] HMME于620 nm處有一吸收峰，是理想的PDT治療光源波長(zhǎng)；HMME在細(xì)胞內(nèi)呈紅色熒光，分布局限于細(xì)胞漿內(nèi)。當(dāng)濃度≥30μg/ml時(shí)，PDT對(duì)SKOV3光毒性進(jìn)入平臺(tái)期；而低劑量PDT時(shí)呈現(xiàn)明顯的劑量．效應(yīng)關(guān)系；高濃度HMM