新型國產(chǎn)光敏劑葉綠酸f介導的光動力作用膀胱癌的實驗研究.pdf

1、新型國產(chǎn)光敏劑葉綠酸f介導的光動力作用膀胱癌的實驗研究研究目的葉綠酸f是由本課題組最近研制開發(fā)的具有自主知識產(chǎn)權的新型光敏劑，其基本的光動力學特性以及對膀胱癌的光動力殺傷效果和機制尚不清楚。
　　目的：明確葉綠酸f的制備流程及其光動力學特性，探討其介導的光動力學作用對膀胱癌細胞的體外殺傷效果及其可能的機制，為其下一步的臨床應用提供堅實的基礎理論支持。
　　方法：1、首先從原料中藥蠶砂中提取得到葉綠素粗制品，經(jīng)堿水解、分離、提

2、取、純化等步驟得到純度極高的葉綠酸e6，再由葉綠酸e6制備葉綠酸f以及其對應的鈉鹽。2、采用質譜儀(Mass spectrometry, MS)分析葉綠酸f分子量，高壓液相色譜(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析葉綠酸f樣品的純度，熒光分光光度計分析其吸收光譜，應用1，3-二苯基異苯并呋喃(DPBF)檢測其產(chǎn)生1O2的能力。3、體外培養(yǎng)膀胱癌5637和T24細胞到對數(shù)生長期，然

3、后應用CCK-8法檢測不同濃度的葉綠酸f在不同能量密度的650nm波長激光激發(fā)下對膀胱癌5637和T24細胞的生長抑制作用，倒置顯微鏡下觀測膀胱癌細胞的形態(tài)學改變。4、將葉綠酸f與5637和T24細胞孵育4h后，再用線粒體特異性探針標記線粒體，應用激光共聚焦顯微鏡(Confocal laser scanning microscope，CLSM)檢測葉綠酸f在細胞內(nèi)的亞細胞分布;對葉綠酸f光動力學治療(Photodynamic thera

4、py, PDT)12h后的5637和T24細胞應用DAPI染色，熒光顯微鏡下觀測細胞的形態(tài)學改變;采用流式細胞儀(Flowcytometry, FCM)分析葉綠酸f光動力學處理12h后5637和T24細胞的凋亡率。5、采用細胞凋亡蛋白抗體芯片技術檢測5637和T24細胞光動力處理前后bad、bax、BID、BIM、Bcl-2、Bcl-w、Caspase-3、Caspase-8和細胞色素C、XIAP、SMAC等凋亡相關蛋白的表達情況，探討

5、葉綠酸f光動力學作用誘導5637和T24細胞凋亡的可能機理。6、將葉綠酸f與5637和T24細胞孵育2h后，應用溶酶體特異性探針標記溶酶體，激光共聚焦顯微鏡下觀測葉綠酸f在細胞內(nèi)的亞細胞分布;westemblot方法檢測葉綠酸f光動力學處理前后5637和T24細胞中LC3，Beclin1蛋白的表達情況;分別應用Cyto-ID?自噬特異性染料、單丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverin，MDC)、吖啶橙（Acridine Or

6、ange，AO）染料對葉綠酸f光動力學處理后的5637和T24細胞進行染色，然后激光共聚焦顯微鏡下觀測細胞的形態(tài)學改變;透射電鏡(Transmission Electron Microscope，TEM)下觀察葉綠酸f光動力學處理1h后5637和T24細胞超微結構的變化。7、應用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)對5637和T24細胞進行預處理1h，然后給與f-PDT處理，分別采用CCK-8法以及流式細

7、胞儀分析葉綠酸f光動力學處理后5637和T24細胞的生長抑制率和凋亡率。
　　結果：1、制得的葉綠酸f樣品純度為90.19％，相對分子量為539.3，其吸收峰為653.5nm，599.0nm，501.5nm以及398.5nm，其中398.5nm和653.5nm處吸收峰最強;葉綠酸f與DPBF溶液共孵育后，采用波長為405nm，能量密度為40mW/cm2的紅光分別激發(fā)15s，30s，45s，60，75s，熒光光譜儀結果顯示DPBF的

8、熒光強度隨著激光激發(fā)時間的延長而逐漸下降。2、葉綠酸f各濃度1、2和4ug/ml對5637細胞生長抑制率在4J/cm2下分別為33.92％、57.38％和84.88％，在2J/cm2則相應為25.4％、51.21％和70.09％，各濃度2.5ug/ml、5ug/ml、10ug/ml對T24細胞生長抑制率在4J/cm2下分別為34.03％、60.11％和86.51％，在2J/cm2為31.79％、53.83％和72.89％。3、5637和

9、T24細胞先后與葉綠酸f，線粒體探針孵育后，激光共聚焦顯微鏡結果顯示400nm激發(fā)葉綠酸f發(fā)出的紅色熒光與488nm激發(fā)線粒體探針產(chǎn)生的綠色熒光分布基本一致。4、熒光顯微鏡下DAPI染色結果可見f-PDT處理后5637和T24細胞均出現(xiàn)胞核邊緣不規(guī)則，核固縮，核溶解、碎裂，核小體碎片增加等細胞凋亡的典型特征，而空白對照組細胞則未見到明顯的凋亡細胞。5、5637細胞在4ug/ml葉綠酸f和4J/cm2激光條件下，光動力處理后，行流式細胞檢

10、測，細胞凋亡率為50.61±1.66％，細胞對照組凋亡率為4.05±0.12％; T24細胞在10ug/ml葉綠酸f和4J/cm2激光條件下，光動力處理后，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率為54.3±1.32％，細胞對照組凋亡率為11.31±0.71％。兩種細胞中PDT處理組與細胞對照組之間差異有顯著性意義(P＜0.01)。6、在5637細胞PDT處理組中促凋亡蛋白bad、BID、BIM較對照組有不同程度的升高，分別為對照組的1.25倍，1.

11、38倍和1.23倍;而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-w相較于對照組則有明顯的下降，分別為對照組的0.25倍和0.48倍;處理組細胞色素C水平高于對照組，是對照組的1.32倍;Caspase3相較于處理組也有一定程度的升高，為對照組的1.35倍，Caspase8則相對于對照組無明顯改變;凋亡抑制蛋白XIAP處理組明顯低于對照組，是對照組的0.34倍;促凋亡蛋白SMAC處理組則高于對照組，為對照組的1.14倍。在T24細胞處理組中促凋亡蛋白

12、bad、bax、BID、BIM較對照組有不同程度的升高，分別為對照組的2.39倍，1.55倍，2.06倍和1.19倍;而抗凋亡蛋白Bcl-2與Bcl-w相較于對照組均有一定程度的下降，分別為對照組的0.83和0.82倍;處理組細胞色素C水平高于對照組，是對照組的1.55倍;Caspase3和Caspase8處理組對比對照組均有一定程度的升高，分別為對照組的1.42倍和1.18倍;凋亡抑制蛋白XIAP處理組低于對照組，是對照組的0.82倍

13、;促凋亡蛋白SMAC處理組高于對照組，為對照組的1.35倍。7、兩種細胞與葉綠酸f孵育2h后，再與溶酶體探針孵育，激光共聚焦顯微鏡結果顯示葉綠酸f自身的紅色熒光與504nm激發(fā)溶酶體探針產(chǎn)生的綠色熒光分布基本一致。8、Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白在5637和T24細胞PDT處理組中表達增高，均呈一定的時間依賴性。9、Cyto-ID?自噬特異性綠色染料，MDC以及AO染色后，激光共聚焦結果顯示5637和T24細胞內(nèi)在f-PDT后1h，2

14、h和4h均先后形成自噬體(autophagosomes)，晚期自噬體以及自噬溶酶體(autolysosomes)結構。10、5637和T24細胞光動力學處理后，透射電鏡檢測顯示細胞內(nèi)很多雙層膜樣結構的自噬體，其內(nèi)部可見到胞質成分以及受損的細胞器。對照組無相應改變。11、3-MA預處理+PDT處理組中5637細胞的生長抑制率為93.52％，而對應的PDT處理組中5637細胞的生長抑制率則為83.15％，3-MA對照組細胞生長抑制率為6.7

15、3％;同時3-MA預處理+PDT處理組中T24細胞的生長抑制率為95.51％，對應的T24細胞PDT處理組中的細胞生長抑制率為86.19％，3-MA對照組細胞生長抑制率則為5.78％。12、流式細胞術結果顯示，3-MA預處理+PDT處理組中5637細胞的凋亡率69.45±2.14％，而對應的PDT處理組中5637細胞的凋亡率則為50.61±1.66％;同時3-MA預處理+PDT處理組中T24細胞的凋亡率為77.69±1.75，對應的T2

16、4細胞PDT處理組中的細胞凋亡率為54.3±1.32％。兩種細胞中3-MA預處理+PDT處理組與PDT處理組之間差異有顯著性意義(P＜0.05)。
　　結論：1、制備的葉綠酸f純度高，光學特性符合理想光敏劑要求。2、葉綠酸f結合650nm激光，體外光動力作用殺傷膀胱癌5637和T24效果顯著，具有藥物劑量和激光能量依賴性。3、葉綠酸f可以定位在膀胱癌細胞溶酶體以及線粒體中，首先誘導膀胱癌細胞發(fā)生自噬，然后通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)對腫瘤