腦內(nèi)嗅鞘細胞移植對mSOD1G93A ALS大鼠治療作用的研究.pdf

1、目的：觀察熒光大鼠嗅球來源的嗅鞘細胞經(jīng)顱移植到放射冠后對mSOD1G93A轉(zhuǎn)基因ALS大鼠的發(fā)病時間、生存率、行為學(xué)等方面的影響，探討嗅鞘細胞經(jīng)顱移植到放射冠對mSOD1G93A轉(zhuǎn)基因ALS大鼠的治療作用及相關(guān)機制，為臨床ALS治療提供相關(guān)的實驗學(xué)證據(jù)。
　　 方法：⑴出生21天的仔鼠剪鼠尾適量，DNA提取后PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察。⑵新生1周的SD大鼠，熒光顯微鏡下觀察，篩選出熒光表現(xiàn)陽性的大

2、鼠備用，先用碘伏消毒其全身，尤其是頭頸部，再用酒精噴灑脫碘后拿到超凈工作臺內(nèi)，用消毒剪沿頸部剪下，換剪刀后沿頭頂正中線剪開皮膚和顱骨，取出雙側(cè)嗅球，放于冰塊上的DF-12內(nèi)，清洗三遍，解剖鏡下剝膜，頭部難剝離部分可適當(dāng)保留，用眼科剪剪成1立方毫米大小的組織塊，將剪碎的組織塊移入15ml離心管，用彎頭吸管來回輕輕吹打，制成細胞懸液，胰蛋白酶消化后收集細胞，以13％的血清培養(yǎng)基制成細胞懸液平均鋪入經(jīng)多聚賴氨酸包板后的細胞培養(yǎng)板中，在CO2培

3、養(yǎng)箱中培養(yǎng)。⑶包括形態(tài)學(xué)鑒定和免疫熒光染色鑒定，形態(tài)學(xué)鑒定可在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，類似小蝌蚪樣，胞體呈球形或星形，周圍有突起。Hoechst標記細胞核，同時用P75NGFR和S-100染色進行免疫熒光鑒定，激光共聚焦顯微鏡下觀察，染色雙陽性細胞與總細胞數(shù)量相比即得到嗅鞘細胞的純度。⑷嗅鞘細胞移植所用儀器是立體定位儀，對象是90日齡野生型大鼠和mSOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠。大鼠4％水合氯醛麻醉后，俯臥于手術(shù)臺上，用立體定位儀固定，

4、去掉大鼠頭部的毛發(fā)，在顱骨距離前囟2毫米，中線右側(cè)1.5毫米的位置開一個直徑大約5毫米的孔，玻璃微注射器插入到放射冠(距離表面2.75毫米)。將5微升的細胞懸液(約個5×105嗅鞘細胞)或者是DF12在十分鐘之內(nèi)緩慢的注射到孔內(nèi)。手術(shù)過程中不使用環(huán)胞霉素，而在術(shù)后所有動物連續(xù)三天按每天每千克體重10毫克的量皮下注射青霉素預(yù)防感染。⑸所有實驗動物自出生后90天起進行發(fā)病時間、生存時間、體重及相應(yīng)行為學(xué)實驗的觀察。⑹所有實驗動物分別于細胞移

5、植后5周(125天)及7周(139天)取大腦皮層和腰段脊髓進行組織學(xué)檢測。細胞移植后五周取材的脊髓做冠狀切片的尼氏染色，計算各組的神經(jīng)元數(shù)量。顯微鏡下觀察運動神經(jīng)元，記錄細胞形態(tài)完整的運動神經(jīng)元細胞數(shù)量。⑺細胞移植后五周和七周取材的冰凍切片做ChAT蛋白的免疫組織化學(xué)染色。冰凍切片機切片后將片子放到37度烤箱內(nèi)烤30分鐘，進行防脫片處理，放到搖床上用PBS洗三遍，血清孵育2h后加入一抗過夜，復(fù)溫后再洗三遍，加入二抗室溫孵育1小時，Hoe

6、chst進行細胞核染色，封片保存待觀察。⑻處死大鼠后快速取所需要的組織并提取蛋白，測定濃度后進行瓊脂糖凝膠電泳，將電泳產(chǎn)物進行硝酸纖維素轉(zhuǎn)膜，產(chǎn)物進行封閉雜交，暗室內(nèi)曝光，凝膠圖像分析儀掃描得到的圖像，Quantity One軟件分析條帶光密度。
　　 結(jié)果：①嗅鞘細胞移植到SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠放射冠兩周后，熒光顯微鏡下觀察表達綠熒光蛋白的嗅鞘細胞在移植大鼠的放射冠移植點周圍彌散分布。移植后5周，彌散到更遠的地方，移植后7

7、周，逐漸消失，但仍有少量存活。②各組大鼠的四肢出現(xiàn)異常的平均時間均為125天左右，即各組發(fā)病時間沒有統(tǒng)計學(xué)意義。而嗅鞘細胞移植組的生存時間和疾病過程中的各項指標均明顯好于其他幾組，即細胞移植延長了大鼠的生存時間，改善了發(fā)病到死亡過程中大鼠的各項生理指標。③大腦皮層和腰段脊髓的前角運動神經(jīng)元尼氏染色顯示，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠發(fā)病后出現(xiàn)運動神經(jīng)元的大量死亡，并有統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.001)。OEC移植組SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠的運動

8、神經(jīng)死亡的數(shù)量遠少于其他兩組。ChAT的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與尼氏染色結(jié)果一致。④野生的陽性對照組大鼠的ChAT蛋白水平遠高于嗅鞘細胞移植組，但細胞移植組又高于未經(jīng)治療的其他兩組，并均有統(tǒng)計學(xué)差異。而培養(yǎng)基注射組和SOD1G93A組的ChAT蛋白水平無統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01)。
　　 結(jié)論：嗅鞘細胞移植可以延緩SOD1G93A轉(zhuǎn)基因大鼠的發(fā)病時間，改善發(fā)病后大鼠的運動功能，并使其生存時間相應(yīng)延長，移植后的嗅鞘細胞可以在大鼠體內(nèi)