嗅鞘細(xì)胞移植聯(lián)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 脊髓損傷嚴(yán)重影響著25萬(wàn)美國(guó)人的生活質(zhì)量，恢復(fù)緩慢，因此成為全世界科學(xué)家的研究熱點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)，許多藥物、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、組織細(xì)胞移植及基因治療是目前主要的脊髓損傷修復(fù)措施。其中，終生具有成髓鞘能力的嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells，OECs)深受廣大研究人員的喜愛(ài)。脊髓損傷引起的缺血和繼發(fā)性改變使局部條件惡化，加重了神經(jīng)損傷。因此，改善脊髓損傷局部的血液循環(huán)，減輕繼發(fā)性損傷便成為脊髓損

2、傷的又一研究熱點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在脊髓損傷后表達(dá)增加，可能與損傷后的功能恢復(fù)有關(guān)。
　　 目的:
　　 研究一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的獲得新生大鼠嗅鞘細(xì)胞的方法，探討嗅球源性嗅鞘細(xì)胞(OECs)移植和鞘內(nèi)重復(fù)注射VEGF對(duì)脊髓損傷(SCI)后功能恢復(fù)的促進(jìn)作用，并研究二者對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)纖維的協(xié)同保護(hù)作用。
　　 方法:

3、　　 取1-2天的雌性新生大鼠，無(wú)菌條件下取下雙側(cè)嗅球，剝?nèi)パ芎蛙浤X膜，經(jīng)胰酶消化和機(jī)械吹打分散成單細(xì)胞懸液，將差速貼壁后的大鼠嗅鞘細(xì)胞首先應(yīng)用20％胎牛血清和10ug/ml阿糖胞苷培養(yǎng)24小時(shí)，然后采用含1％胎牛血清和25ng/ml神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)的DMEM/F12培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)。每天觀察嗅鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)變化，第9天時(shí)采用形態(tài)學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)染色對(duì)細(xì)胞及其純度進(jìn)行鑒定，并收集細(xì)胞，調(diào)

4、整細(xì)胞密度為1x107/ml備用。
　　 將75只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，假手術(shù)對(duì)照組(CON組)、脊髓損傷組(SCI組)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子組(VEGF組)、嗅鞘細(xì)胞組(OECs組)和聯(lián)合治療組（VEGF+OECs組），在脊髓損傷后不同時(shí)段進(jìn)行肢體活動(dòng)BBB評(píng)分，術(shù)后8w苯巴比妥麻醉后灌注處死大鼠，取T7-L1脊髓節(jié)段，通過(guò)HE染色檢測(cè)脊髓損傷區(qū)神經(jīng)纖維和神經(jīng)元病理改變；通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠脊髓caspase-3(1：15

5、0)和vWF(1：200)表達(dá)。每組3只動(dòng)物利用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)以(-x)±s表示，BBB評(píng)分采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，判斷行為恢復(fù)情況。其他數(shù)據(jù)的組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 體外培養(yǎng)的大鼠嗅鞘細(xì)胞神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體p75(nerve growth factor receptor p75，NGFRp7

6、5)染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞呈雙極和三級(jí)，突出細(xì)長(zhǎng)，并漸結(jié)成網(wǎng)狀，在體外培養(yǎng)的第7天純度為95％，9天時(shí)為90％，且形態(tài)良好。
　　 術(shù)前所有大鼠和術(shù)后對(duì)照組后肢行為評(píng)分為21分，術(shù)后脊髓損傷動(dòng)物均出現(xiàn)后肢運(yùn)動(dòng)功能的自行恢復(fù)，尤其在手術(shù)后的前4周。在4周后，VEGF組和OECs組優(yōu)于SCI組，聯(lián)合治療組的行為恢復(fù)更為明顯。
　　 HE染色和超微結(jié)構(gòu)觀察可見(jiàn)，CON組損傷處殘留少量組織，神經(jīng)纖維和神經(jīng)元損害嚴(yán)重，大量有髓纖維嚴(yán)

7、重受損，中央軸突消失；VEGF組損傷處均見(jiàn)組織增生，神經(jīng)纖維和神經(jīng)元受損較CON組輕，OECs組細(xì)胞中有大量空泡化的線粒體，OECs+VEGF組神經(jīng)纖維和神經(jīng)元損傷最輕，腹側(cè)有神經(jīng)纖維通過(guò)，大量薄髓鞘纖維中可見(jiàn)微絲、微管和受損較輕線粒體。
　　 免疫組化顯示，CON組、SCI組、VEGF組、OECs組和VEGF+OECs組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為（8.33±5.43）、(25.89±10.75)、(14.62±5.60

8、)、（23.47±8.33）、（13.38±6.33）/HPF，SCI組、VEGF組、OECs組和VEGF+OECs組均顯著高于CON組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):SCI組、OECs組顯著高于VEGF組、VEGF+OECs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；
　　 CON組、SCI組、VEGF組、OECs組和VEGF+OECs組脊髓中vWF陽(yáng)性血管數(shù)分別(13.87±2.59)、(11.25±3.19)、(14.42±

9、4.05)、(11.94±3.77)、(16.50±6.25)/HPF。VEGF組、VEGF+OECs組vWF陽(yáng)性血管數(shù)顯著多于SCI組、OECs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、阿糖胞苷結(jié)合NGF是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的嗅鞘細(xì)胞純化培養(yǎng)方法．
　　 2、VEGF對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)有一定的促進(jìn)作用，并可恢復(fù)損傷神經(jīng)的部分功能，對(duì)受損神經(jīng)纖維和神經(jīng)元有保護(hù)作用。
　　 3、嗅鞘細(xì)胞移植

10、可部分恢復(fù)脊髓損傷大鼠的部分神經(jīng)功能，對(duì)受損神經(jīng)纖維和神經(jīng)元有保護(hù)作用。
　　 4、嗅鞘細(xì)胞(OECs)移植聯(lián)合鞘內(nèi)重復(fù)注射VEGF對(duì)大鼠脊髓損傷修復(fù)有明顯的促進(jìn)作用，并可恢復(fù)損傷神經(jīng)的部分功能，對(duì)受損神經(jīng)纖維和神經(jīng)元有保護(hù)作用，二者有協(xié)同作用。
　　 意義
　　 本研究采用阿糖胞苷結(jié)合NGF體外培養(yǎng)純化大鼠嗅球源性嗅鞘細(xì)胞，重力打擊制作脊髓挫傷模型，將嗅鞘細(xì)胞移植到脊髓損傷部位，聯(lián)合重復(fù)鞘內(nèi)注射VEGF，探討O