淫羊藿黃酮的分離鑒定及其抗骨質(zhì)疏松活性的機制探討.pdf

1、傳統(tǒng)中藥淫羊藿由于其豐富的藥用植物資源、多樣的藥理作用和確切的臨床療效而備受關(guān)注，一直是國內(nèi)外研究的熱點。為了更好地開發(fā)利用這一資源，我們設(shè)計并開展了以下實驗：(1) 以小鼠骨髓基質(zhì)細胞為模型，采用四甲基偶氮唑藍法、堿性磷酸酶比活性測定方法，在細胞水平篩查了淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的有效極性部位；(2) 利用硅膠和凝膠柱層析分離淫羊藿有效部位中的單體成分，根據(jù)化合物光譜數(shù)據(jù)(ESI-MS，<'1>HNMR和<'13>CNMR)鑒定其結(jié)構(gòu)；(3)

2、 以小鼠骨髓基質(zhì)細胞為模型，采用四甲基偶氮唑藍法、堿性磷酸酶比活性測定、茜素紅染色及定量測定和油紅O染色及定量測定等方法，在細胞水平研究了淫羊藿有效部位和其中分離出的主要單體淫羊藿苷，以及淫羊藿苷代謝產(chǎn)物寶藿苷I對小鼠骨髓基質(zhì)細胞增殖、成骨和成脂分化的影響；(4) 以小鼠成骨細胞為模型，采用四甲基偶氮唑藍法、油紅O染色及定量測定等方法，在細胞水平研究了淫羊藿有效部位、淫羊藿苷及寶藿苷I對小鼠成骨細胞增殖及橫向分化的影響；(5) 采用蛋白

3、印跡和熒光定量PCR等方法，在分子水平對淫羊藿苷在骨髓基質(zhì)細胞成骨和成脂分化途徑中可能的作用靶點和作用途徑進行了研究；(6) 采用MTT法和DPPH法測定6個淫羊藿黃酮對前破骨細胞株RAW264.7增殖的影響以及它們的細胞毒性和抗氧化清除自由基的能力。 研究結(jié)果表明： (1) 淫羊藿促進骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化的有效部位是乙酸乙酯萃取部位和水提物； (2) 從淫羊藿藥材乙酸乙酯萃取部位中分離鑒定的6個黃酮

4、類成分，分別為淫羊藿苷(I)，寶藿苷Ⅱ(Ⅱ)，朝藿素B(Ⅲ)，寶藿苷I(Ⅳ)，金絲桃苷(v)和木犀草素(Ⅵ)； (3) 細胞水平上淫羊藿乙酸乙酯萃取部位可以促進小鼠骨髓基質(zhì)細胞向成骨細胞分化而不抑制其向脂肪細胞分化。乙酸乙酯萃取物中主要成分淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物寶藿苷I，在一定濃度范圍內(nèi)，可以促進小鼠骨髓基質(zhì)細胞成骨分化并抑制其成脂分化，此作用與化合物結(jié)構(gòu)、濃度及作用時間均有關(guān)，尤以10<'-9>和10<'-8>Smol／L的淫

5、羊藿苷在第14d的效果最好； (4) 細胞水平上，在一定濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯萃取部位、淫羊藿苷及寶藿苷I可以抑制小鼠成骨細胞向脂肪細胞的橫向分化，以10<'-9>和10<'-8>mol/L。的淫羊藿苷在第6d的效果最好； (5) 淫羊藿苷可能通過對ERa蛋白表達的作用影響小鼠骨髓基質(zhì)細胞成骨分化和成脂分化。以上結(jié)果說明淫羊藿苷作為淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的有效成分，在合適的濃度和作用時間下，可以雙向調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)細胞的成骨和成

6、脂分化，同時抑制成骨細胞的成脂橫向分化：一方面通過增加成骨細胞的數(shù)量而直接促進骨形成，另一方面通過減少脂肪細胞的數(shù)量而間接促進骨髓基質(zhì)細胞成骨分化并降低脂肪細胞對破骨細胞的促進作用，從而在整體水平上使骨量增加，達到防治骨質(zhì)疏松的作用，而ERa則是淫羊藿苷發(fā)揮作用的可能靶點之一。 (6) 另外，其他生物活性篩查實驗表明：淫羊藿黃酮類化合物對前體破骨細胞株RAW264.7細胞的生長是促進還是抑制依賴于其自身的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及作用濃度。