淡豆鼓異黃酮抗骨質(zhì)疏松分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：前期研究發(fā)現(xiàn)，淡豆豉(Semen Sojae Preparatum)能糾正去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)的異常，改善骨的微細(xì)結(jié)構(gòu)及骨生物力學(xué)性能，提高骨密度，有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性，但其作用機(jī)制尚不十分清楚。為明確淡豆豉抗骨質(zhì)疏松作用的靶點(diǎn)和途徑，本研究以淡豆豉的主要活性部位淡豆豉異黃酮(Semen Sojae Preparatum Isoflavone，SSPI)為研究對(duì)象，采用體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的方法，從細(xì)胞及分子等不同

2、水平觀察其對(duì)成骨細(xì)胞的影響，旨在從雌激素受體途徑探討其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，為擴(kuò)大淡豆豉臨床應(yīng)用及篩選抗骨質(zhì)疏松新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響
　　1.1大鼠顱骨成骨細(xì)胞(OB)原代培養(yǎng)與鑒定
　　采用改良的組織塊法分離培養(yǎng)新生(24 h)SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞。用堿性磷酸酶染色鑒定成骨細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及ALP染色陽(yáng)性率。
　　1.2淡豆豉異

3、黃酮對(duì)體外培養(yǎng)OB的細(xì)胞毒性檢測(cè)
　　SSPI濃度梯度設(shè)定為1、100、1000、5000、10000、50000、100000、500000μg/L，作用時(shí)間為24 h；MTT法測(cè)定各孔的存活率，以O(shè)D值表示。
　　1.3淡豆豉異黃酮作用濃度及時(shí)間確定
　　SSPI干預(yù)濃度為如下梯度：1、10、50、100、200、500、1000、5000、10000、50000、100000μg/L，分別作用24 h，48 h，

4、72 h；MTT法進(jìn)行測(cè)定，確定其促增殖的最佳作用濃度與時(shí)間。
　　1.4淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增值與分化的影響
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(control)，淡豆豉異黃酮組(SSPI)：1、10、100、1000μg/L，雌二醇組E2(10-9mol/L)，大豆異黃酮組(ISO)：1000μg/L，并設(shè)立雌激素受體拮抗劑ICI182780組，即淡豆豉異黃酮SSPI(1000μg/L)+ICI182780(10-8mol/L)，

5、以初步觀察SSPI是否通過(guò)雌激素受體途徑對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。且ICI182780于淡豆豉異黃酮干預(yù)前2 h進(jìn)行孵育。作用時(shí)間分別為48 h和72 h。
　　1.4.1 MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖情況
　　采用噻唑藍(lán)比色(MTT)法，檢測(cè)淡豆豉異黃酮24 h，48 h，72 h對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖功能的影響。
　　1.4.2成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測(cè)
　　采用堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒，測(cè)定淡豆豉異黃酮48 h和72 h成骨

6、細(xì)胞ALP活性，檢測(cè)其對(duì)大鼠成骨細(xì)胞早期分化的影響。
　　1.4.3成骨細(xì)胞羥脯氨酸含量的測(cè)定
　　采用消化法，測(cè)定淡豆豉異黃酮48 h和72 h成骨細(xì)胞內(nèi)羥脯氨酸含量，檢測(cè)其對(duì)成骨細(xì)胞膠原蛋白含量的影響。
　　2淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠成骨細(xì)胞雌激素受體(Estrogen Receptor，ER)表達(dá)的影響
　　2.1不同濃度SSPI對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)水平的影響
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，淡豆

7、豉異黃酮1、10、100、1000μg/L不同濃度組。作用72 h。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法測(cè)定不同濃度SSPI干預(yù)后成骨細(xì)胞ERα、ERβ mRNA的表達(dá)。
　　2.2 SSPI與ISO對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)水平的比較
　　實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組，淡豆豉異黃酮組(SSPI1000μg/L)，雌二醇組E2(10-9 mol/L)，大豆異黃酮組(ISO1000μg/L)，并設(shè)立雌激素受體拮抗劑

8、組，即淡豆豉異黃酮SSPI(1000μg/L)+ICI182780(10-8mol/L)，且ICI182780于SSPI干預(yù)前2 h進(jìn)行孵育。作用72 h。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR法測(cè)定各藥物干預(yù)后成骨細(xì)胞ERα、ERβ mRNA的表達(dá)。
　　2.3不同濃度SSPI對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ蛋白表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)同2.1。RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Western blot法檢測(cè)ERα、E

9、Rβ蛋白表達(dá)水平。
　　2.4 SSPI與ISO對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ蛋白表達(dá)水平的比較
　　實(shí)驗(yàn)分組及藥物干預(yù)同2.2。RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，Westernblot法檢測(cè)ERα、ERβ蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠成骨細(xì)胞增殖與分化的影響
　　1.1成骨細(xì)胞形態(tài)觀察
　　倒置相差顯微鏡下，原代培養(yǎng)24 h～36 h即可見(jiàn)成骨細(xì)胞自顱骨碎片移出，未貼壁的為小球形，呈懸浮

10、狀態(tài)，貼壁的呈短梭形或三角形，以骨塊為中心，向周?chē)史派渖L(zhǎng)，細(xì)胞排列無(wú)方向性。傳代細(xì)胞最初接種時(shí)呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中；24 h可見(jiàn)大部分細(xì)胞貼壁、伸展，初時(shí)細(xì)胞形狀不規(guī)則，呈多邊形、三角形等。培養(yǎng)3 d后，OB形狀基本穩(wěn)定，呈纖維束狀、長(zhǎng)梭形、條索狀，細(xì)胞相互之間聯(lián)系密切，融合成片，分界較為模糊。培養(yǎng)5d左右細(xì)胞呈鋪路石狀。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸聚集形成細(xì)胞小結(jié)。
　　1.2成骨細(xì)胞的鑒定
　　堿性磷酸酶染色：實(shí)驗(yàn)

11、用成骨細(xì)胞染色后顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)散在的紫藍(lán)色沉淀，呈典型的ALP染色陽(yáng)性反應(yīng)。細(xì)胞染色深淺不等，陽(yáng)性細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形和鱗片形，成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性率達(dá)93％。
　　1.3淡豆豉異黃酮的細(xì)胞毒作用
　　淡豆豉異黃酮濃度達(dá)到50000μg/L時(shí)，OD值較空白對(duì)照組顯著降低(P＜0.01)，多數(shù)細(xì)胞皺縮成球形、少數(shù)死亡細(xì)胞漂浮在孔中。提示SSPI濃度大于50000μg/L時(shí)，出現(xiàn)明顯細(xì)胞毒作用。
　　1.4淡豆豉異黃酮

12、作用濃度及時(shí)間確定
　　不同濃度淡豆豉異黃酮干預(yù)細(xì)胞對(duì)OB的增殖產(chǎn)生了不同程度的促進(jìn)作用，根據(jù)MTT結(jié)果分析確定SSPI作用濃度為1、10、100、1000μg/L；作用時(shí)間為48 h和72 h。
　　1.5淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞增殖功能的影響
　　與空白對(duì)照組比較，除ICI182780組，各組藥物在干預(yù)48 h或72 h后OD值均顯著升高(P＜0.05)。SSPI干預(yù)效應(yīng)隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(P＜0.05)，隨著

13、濃度的改變無(wú)明顯的變化(P＞0.05)，以SSPI1000μg/L組72 h作用最強(qiáng)，高于ISO組，且可被ICI182780所拮抗。
　　1.6淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響
　　與空白對(duì)照組比較，除ICI182780組，各組藥物在干預(yù)48 h或72 h后均增加細(xì)胞內(nèi)ALP活性。不同濃度的SSPI組與E2比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其中以SSPI1μg/L組最強(qiáng)(P＜0.05)，其次為ISO組(P＜0.05)。ICI1

14、82780組與空白對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異，與SSPI1000μg/L組比較OD值有降低趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　1.7淡豆豉異黃酮對(duì)成骨細(xì)胞羥脯氨酸含量的影響
　　與空白對(duì)照組比較，除ICI182780組，各組藥物在干預(yù)48 h或72 h后均增加細(xì)胞內(nèi)羥脯氨酸的含量。SSPI1000μg/L較之10-9mol/L雌二醇作用無(wú)顯著差異(P＞0.05)，高于同劑量ISO組。且可被ICI182780所拮抗。不同

15、濃度的SSPI組與雌二醇比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　2淡豆豉異黃酮對(duì)大鼠成骨細(xì)胞雌激素受體表達(dá)的影響
　　2.1不同濃度SSPI對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)的影響
　　與空白對(duì)照組相比，不同濃度SSPI均上調(diào)ERβ mRNA表達(dá)(P＜0.01)；其中SSPI1000μg/L表達(dá)最高，其次為SSPI10μg/L，其余兩組組間無(wú)差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到ERα mRNA的表達(dá)。
　　2.2

16、 SSPI與ISO對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ mRNA表達(dá)水平的比較
　　與空白對(duì)照組相比，SSPI(1000μg/L)，E2(10-9mol/L)ERβ mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)；ISO(1000μg/L)組ERβ mRNA有升高趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；SSPI作用弱于E2，且可被ICI182780所拮抗。實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到ERα mRNA的表達(dá)。
　　2.3不同濃度SSPI對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ蛋白表

17、達(dá)的影響
　　不同濃度SSPI組ERβ蛋白表達(dá)較空白組均升高(P＜0.01)，其中SSPI1000μg/L表達(dá)最高；SSPI1、10、100μg/L三組組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)果顯示SSPI對(duì)成骨細(xì)胞ERβ蛋白表達(dá)無(wú)明顯劑量依懶關(guān)系。實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到ERα蛋白的表達(dá)。
　　2.4 SSPI與ISO對(duì)成骨細(xì)胞ERα、ERβ蛋白表達(dá)水平的比較
　　與空白對(duì)照組相比，SSPI1000μg/L，E2(10-9mol/L

18、)，ISO1000μg/L組ERβ蛋白表達(dá)均顯著升高(P＜0.01或P＜0.05)；SSPI1000μg/L作用最顯著，高于同劑量ISO組，且可被ICI182780所拮抗。實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到ERα蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1淡豆豉異黃酮(1～1000μg/L)可顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化以及骨基質(zhì)形成，其中1000μg/L作用最顯著，且該效應(yīng)可被雌激素受體拮抗劑ICI182780所拮抗，提示SSPI可能通過(guò)雌激素受體途徑調(diào)控