CD151-AAA194-196的表達對大鼠缺血后肢血管新生影響及其分子機制的研究.pdf

1、研究目的:血管新生是體內(nèi)重要的病理生理過程，在腫瘤的轉移浸潤以及缺血性疾病的血運重建等病理生理過程中發(fā)揮著十分重要的作用，它是指內(nèi)皮細胞通過增殖和分化在原有血管基礎上以芽生或非芽生的形式生成血管。目前關于血管形成的基本機制還存在爭議，但是整合素在血管形成的過程中發(fā)揮重要的作用這一觀點已得到認同。整合素是位于細胞表面的異二聚體粘著受體，與胞外基質蛋白相結合，由一個α亞基和一個β亞基組成，a3b1和a6b1是層粘連蛋白連接整合素，可以和四跨

2、膜超家族蛋白（tetraspanins）形成復合體。CD151是四跨膜超家族蛋白（TM4SF）的最重要成員之一，他可以通過通過胞外大環(huán)特異性位點QRD194-196與整合素a3b1或a6b1相連，形成CD151–a3b1/a6b1功能性復合體，進而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、粘附功能以及信號轉導通路，過去的研究表明CD151能促進缺血心肌和缺血后肢組織的血管新生，改善這些組織器官的功能。有研究表明CD151抗體也可以抑制內(nèi)皮細胞的遷移過程

3、，相似的結果也可以在應用整合素α3抗體的內(nèi)皮細胞中觀察到，基于這些發(fā)現(xiàn)，推測切斷CD151與整合素a3b1，a6b1之間的連接可以抑制血管新生。在本研究中，構建了整合素a3/a6結合缺陷的CD151–QRD194–196→AAA，通過重組腺相關病毒載體(rAAV)將CD151–QRD194–196→AAA突變體轉染至大鼠后肢肌肉組織中，然后建立后肢缺血模型，觀察CD151突變體的基因表達能否促進缺血后肢的血管新生過程，同時觀察該突變體對

4、FAK，PI3K/Akt/eNOS通路、ERK通路、Cdc42和Rac1通路的影響，通過上述研究結果進一步揭示CD151促血管新生的分子機制。
　　 研究方法:
　　 1．構建pAAV-GFP、pAAV-CD151以及pAAV-CD151–QRD194–196→AAA質粒。擴增、提取、純化質粒后，使用三質粒共轉染法包裝制備rAAV-GFP，rAAV-CD151和rAAV-CD151–AAA突變體病毒。病毒包裝成功后通過斑

5、點雜交法來檢測所包裝的病毒的滴度。
　　 2．成年雄性Wistar大鼠30只（重200～250g）隨機分為5組，每組6只，其中四組分別給于生理鹽水，rAAV-GFP，rAAV-CD151和rAAV-CD151–AAA194–196(1.5×l011 pfu/只)分點注射至大鼠左側后肢肌肉組織內(nèi)，注射位點分別為：股四頭肌(3點)、股內(nèi)收肌(3點)、半膜肌(2點)，腓腸肌(2點)，每個注射位點100ul基因，轉染1周后行股動脈切除術

6、建立大鼠后肢缺血模型，假手術組施行相同的手術步驟但不切除股動脈?；蜣D染5周后測定后肢皮膚溫度；免疫組化法檢測缺血肌肉組織毛細血管密度；Western blot免疫印跡和免疫組化法檢測各組大鼠缺血肢體局部CD151的表達；同時Western blot免疫印跡檢測FAK、PI3K、Akt、eNOS、ERK、Rac1/Cdc42的表達情況，了解CD151-AAA突變體對FAK-MAPKs，F(xiàn)AK-PI3K和Rac1/Cdc42信號通路的影響

7、。
　　 實驗結果:
　　 1．經(jīng)過基因測序鑒定，成功構建了pAAV-CD151-AAA194-196突變體。斑點雜交法檢測各包裝病毒的滴度可以滿足實驗需要。
　　 2．術后5周，CD151和CD151–AAA194–196組的CD151蛋白及AAA194–196突變體蛋白表達水平明顯高于其余各組，CD151和CD151–AAA194–196組兩組蛋白水平無明顯差別，但CD151組大鼠缺血后肢平均皮膚溫度和毛細血

8、管密度明顯高于CD151–AAA194–196組，同時CD151–AAA194–196組大鼠缺血后肢平均皮膚溫度和毛細血管密度與生理鹽水組和GFP組相比無明顯差別，此外，Western blot的結果顯示，CD151組磷磷酸化ERK，酸化FAK，PI3K，磷酸化Akt，磷酸化eNOS和磷酸化Rac1/cdc42的蛋白表達明顯增加，顯著高于其余各組。而CD151-AAA組上述細胞信號分子的表達沒有明顯增加。
　　 實驗結論:

9、>　　 1．成功構建了pAAV-CD151-AAA194-196突變體并且包裝成重組腺相關病毒。
　　 2．研究證實CD151促血管新生是通過形成CD151-整合素a3/a6復合體而實現(xiàn)的，CD151-整合素a3/a6復合體的形成是CD151促血管新生的始動機制，CD151-整合素a3/a6復合體通過激活FAK-MAPKs，F(xiàn)AK-PI3K和Rac1/Cdc42等信號通路來實現(xiàn)調(diào)節(jié)血管新生的作用。
　　 3．CD151