減阻劑對急性后肢缺血大鼠運動耐力的影響及其可能的作用機制.pdf

1、研究背景
　　 周圍血管疾病(Peripheral arterial disease，PAD)主要是由動脈粥樣硬化閉塞引起的，是全身系統(tǒng)性動脈粥樣硬化的一個重要表現(xiàn)，臨床主要表現(xiàn)為手足麻木、刺痛，間歇性跛行及靜息痛，動脈搏動減弱或消失等，嚴重者可引起手足潰爛、感染化膿甚至壞疽[1]。其中，間歇性跛行，表現(xiàn)為步行時肌肉疼痛，是周圍血管病患者最早和最常見的癥狀[2]。盡管很多周圍血管病患者并無癥狀，但有7～15％的患者會在5年內(nèi)出現(xiàn)

2、間歇性跛行[3]。而且，間歇性跛行的出現(xiàn)隨著年齡增加而顯著增加，在45～54歲患者中，發(fā)生率為0.6％，在55～64歲患者中發(fā)生率為2.5％，而在65～74歲患者發(fā)生率增加到8.8％，并隨著病情的發(fā)展而逐漸加重，嚴重者可能出現(xiàn)靜息痛，最突出表現(xiàn)為需依賴抬高下肢來緩解癥狀[4]。盡管間歇性跛行主要局限在大腿及腓腸肌，但靜息痛一般出現(xiàn)在足部，在疾病晚期，會因組織灌注不足發(fā)展成缺血性潰瘍和壞疽，而這些病人有超過1/3的人不得不截肢[2,5]，

3、而且五年內(nèi)截肢率為1～3.3％，死亡率高達20％[6]。而且，外周血管疾病的嚴重程度與心肌梗死、缺血性腦卒中和死亡風險密切相關(guān)，患周圍血管病者，無論伴冠心病、腦血管疾病病史或不伴心肌梗死、腦梗死病史，均有大約相同的心血管死亡風險。鑒于周圍血管疾病是一類致殘率及致死率極高的疾病，嚴重威脅人類的生命健康，因此，探索周圍血管疾病的治療手段是極為必要的，治療的目的為減輕癥狀、改善生活質(zhì)量，減少心血管事件發(fā)病率及死亡率。目前主要治療措施包括戒煙、

4、控制血脂、控制血壓、控制糖尿病、抗血小板、抗血栓形成和血管成形術(shù)等，而開展改善患者間歇性跛行疲勞癥狀及改善行走能力，提高生活質(zhì)量的研究尚需進一步探索。
　　 減阻劑(Drag reducing polymers，DRPs)為一類分子量大于106 Da的高分子水溶性線性聚合物[7]。在流體管道中添加少量這種聚合物能使流體阻力下降，從而在恒定壓力下增加流體速率或降低流體阻力，這種減阻效應在1984年被Toms所報道，稱為Toms現(xiàn)象

5、[8]。Toms現(xiàn)象已經(jīng)被應用于各種工業(yè)，包括管道原油運輸、消防、船及潛艇的減阻。近年，在急性及慢性動物模型中加入減阻劑已經(jīng)證明能夠產(chǎn)生積極的血流動力學效應[9,10]。靜脈注射毫摩爾濃度的高分子聚合物能增加主動脈及動脈血流，降低外周血管阻力，而不影響血液粘度和血管張力[11-13];減阻劑能顯著增加兔子側(cè)枝循環(huán)血流，增加正常及糖尿病大鼠的功能毛細血管，減少正常大鼠和用腺苷擴張過的腸系膜動脈的血流阻力[9,10];在主動脈及頸動脈狹窄犬

6、模型中證實，注射減阻劑后能減少湍流形成[14,15];在犬模型中也證實了能增加狹窄髂動脈的血流[16,17]，而且多個動物模型試驗證實長期注射減阻劑能限制動脈粥樣硬化的發(fā)展[18,19];在大鼠急性休克模型中證實，靜脈注射減阻劑能迅速增加血壓、恢復微循環(huán)血流促使組織氧供增加，靜脈應用減阻劑能減少壓力在主動脈及小動脈間的損失，增加毛細血管前灌注壓[20];我課題組已證實減阻劑能增加正常大鼠腹主動脈血流，增加急性后肢缺血大鼠骨骼肌微循環(huán)的血

7、流速度及血流量[21]。本研究擬探討減阻劑能否改善急性后肢缺血大鼠的運動耐力以及其可能的機制。
　　 第一部分減阻劑對急性后肢缺血大鼠腹主動脈血流動力學的影響
　　 目的:
　　 建立急性后肢缺血大鼠模型，觀察應用減阻劑后，大鼠腹主動脈血流量、心率、動脈血壓、中心靜脈壓的變化，初步評價減阻劑的有效性和用藥安全性。
　　 方法:
　　 1、減阻劑的制備
　　 目前動物實驗中應用最多的減阻劑為

8、聚氧化乙烯(Polyethylene oxide，PEO)，本實驗選擇平均分子量為5×106 Da的PEO進行實驗，于生理鹽水中加入準確稱好的PEO，在磁力攪拌器中攪拌24小時配成濃度為0.1％的PEO溶液，將配好的PEO溶液放置于分子截留量為50000Da的透析袋中透析24小時，生理鹽水稀釋成50ppm濃度的PEO溶液備用。
　　 2、動物模型的制備及血流動力學監(jiān)測
　　 大鼠采購后，在實驗室適應性飼養(yǎng)1天[溫度22～

9、26℃、濕度50％左右、明暗周期各12h(8:30AM～8:30PM)的動物房內(nèi)飼養(yǎng)]，于第2天開始在傾角11°的動物跑臺做適應性跑步訓練[速度10m/min×5min/d×3d，速度逐漸增至12m/min]，于第5天用3％戊巴比妥鈉(45mg/kg)進行大鼠腹腔注射麻醉，雙側(cè)腹股溝區(qū)脫毛，開約1 cm大小切口，分離、結(jié)扎、離斷雙側(cè)股動脈，避免損傷股靜脈及股神經(jīng)，消毒后縫合皮膚;術(shù)后大鼠繼續(xù)跑步訓練[速度10m/min×3min/d×4

10、d，速度逐漸增至12m/min][22]，于第14天再行腹腔注射麻醉，建立尾靜脈輸液通道;肢體安置心電電極，監(jiān)測心率;頸動脈置管連接壓力換能器，監(jiān)測血壓;頸靜脈置管，監(jiān)測中心靜脈壓;于腹正中開約3cm切口，小心分離腹主動脈，于腹主動脈與髂總動脈分叉上方約5mm處置入Transonic超聲血流儀的流量探頭，監(jiān)測腹主動脈血流。
　　 3、動物分組及實驗數(shù)據(jù)的記錄
　　 Wisters大鼠共12只，隨機分成2組（實驗組n=6，

11、對照組n=6），待動物模型穩(wěn)定約30分鐘后，經(jīng)大鼠尾靜脈以7ml/h的速度輸注50ppm的PEO溶液（實驗組）及生理鹽水（對照組）持續(xù)10分鐘，持續(xù)監(jiān)測及記錄平靜及給藥后30分鐘內(nèi)大鼠血流量、心率、動脈壓、中心靜脈壓的改變。
　　 結(jié)果:
　　 實驗組大鼠腹主動脈血流量較對照組升高（F=10.994，P＜0.001），峰值明顯升高（6.4±1.1 ml/min vs4.9±0.3 ml/min，F(xiàn)=11.027，P=0.

12、008）;
　　 兩組之間平均動脈壓無統(tǒng)計學差異(F=0.035，P=0.855);
　　 兩組之間中心靜脈壓無統(tǒng)計學差異(F=0.009，P=0.925);
　　 兩組之間心率無統(tǒng)計學差異(F=0.060，P=0.811)。
　　 結(jié)論:
　　 減阻劑能增加急性后肢缺血大鼠的腹主動脈血流量，增加局部血流速度，而對大鼠的平均動脈壓、中心靜脈壓及心率無明顯影響。
　　 第二部分減阻劑對急性后

13、肢缺血大鼠運動耐力的影響及其可能的作用機制
　　 目的：
　　 以急性雙側(cè)后肢缺血大鼠為模型進行力竭運動試驗，觀察應用減阻劑后，兩組大鼠力竭運動時間的差異、大鼠局部肌肉乳酸堆積及血清一氧化氮含量、超氧化物歧化酶活性、肌酸激酶活性、乳酸脫氫酶活性及全血乳酸含量的改變，以初步探討減阻劑對急性后肢缺血大鼠運動耐力的影響及其可能的作用機制。
　　 方法：
　　 1、減阻劑的制備
　　 在生理鹽水中加入稱好

14、的PEO，在磁力攪拌器中攪拌24小時配成濃度為0.1％的PEO溶液，將配好的PEO溶液放置于分子截留量為50000Da的透析袋中透析24小時，生理鹽水稀釋成50ppm濃度PEO溶液備用。
　　 2、動物模型及輸液通道的建立
　　 大鼠進行適應性跑步訓練后，于第5天用3％戊巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔注射麻醉，雙側(cè)腹股溝區(qū)脫毛，開約1cm大小切口，分離、結(jié)扎、離斷雙側(cè)股動脈，避免損傷股靜脈及股神經(jīng)，消毒后縫合皮膚。頸部脫

15、毛，右頸區(qū)開1大小約1～2cm切口，分離暴露右側(cè)頸靜脈，于右頸靜脈置入輸液導管并固定，遠端導管從皮下游離至后頸部固定，每天予肝素鹽水沖管，保持導管通暢。
　　 3、運動方案、動物分組及給藥途徑
　　 大鼠采購后，在實驗室適應性飼養(yǎng)1天，于第2天開始在傾角11°的動物跑臺做適應性跑步訓練[速度10m/min×5min/d×3d，速度逐漸增至12m/min]，第5天建立急性后肢缺血動物模型及留置頸靜脈輸液通道，術(shù)后大鼠繼續(xù)跑

16、步訓練[速度10m/min×3min/d×4d，速度逐漸增至12m/min][22]，于第14天，大鼠隨機分成兩組（實驗組n=32，對照組n=32）實驗組經(jīng)頸靜脈輸液通道以7ml/h的速度輸注50ppm濃度的PEO溶液持續(xù)10分鐘，對照組以7ml/h的速度輸注生理鹽水持續(xù)10分鐘，同時大鼠在動物跑道上行跑步運動試驗[傾斜11°角，速度12m/min]，至大鼠力竭為實驗終點[以大鼠停留在電擊區(qū)域，驅(qū)趕無效為力竭試驗終點][23]。

17、　　 4、記錄指標
　　 記錄大鼠力竭運動時間，運動距離，取全血測乳酸含量，血清測乳酸脫氫酶、肌酸激酶、一氧化氮、超氧化物歧化酶含量、取雙側(cè)腓腸肌測肌肉乳酸含量及肌肉HE染色。
　　 結(jié)果：
　　 與對照組相比較，實驗組大鼠力竭運動時間延長[(774.72±171.49)s vs(687.56±166.08)s，t=2.065，P=0.043];以相同速度運動時實驗組大鼠力竭運動距離延長[(154.94±34.

18、30)m vs(137.51±33.22)m，t=2.065，P=0.043];一氧化氮含量升高[（4.25±1.75）μmol/L vs（3.51±1.06）μmol/L，t=2.037，P=0.047];超氧化物歧化酶活力增高[（62.97±8.70）U/mL vs（58.79±6.75）U/mL，t=2.150，P=0.036];腓腸肌乳酸含量明顯降低[（2.79±0.10）lg mmol/g vs（2.95±0.11）1g mm

19、ol/g，t=-6.506，P＜0.001];而兩組之間肌酸激酶活力[(0.62±0.24)U/mL vs(0.58±0.27) U/mL，t=0.557，P=0.580]、乳酸脫氫酶活力[(6547.61±2593.03U/L vs(6439.93±2180.04)U/L，t=0.180，P=0.858]及全血乳酸含量[(11.65±4.54)mmol/Lvs（11.90±5.51）mmol/L，t=-0.193，P=0.847]無統(tǒng)