用大腸桿菌表達(dá)速效人胰島類似物的研究.pdf

1、糖尿病(diabetes)是嚴(yán)重威脅人類健康的一類慢性代謝性疾病。胰島素(insulin)是糖尿病臨床治療不可替代的藥物,重組人胰島素類似物在糖尿病治療中的顯著優(yōu)勢使之在臨床得到廣泛應(yīng)用,特別是速效胰島素類似物以其起效快和藥效達(dá)峰時間短;可以很好地改善糖尿病患者對注射胰島素藥物的依從性;避免下餐前或黎明低血糖癥發(fā)生幾率而倍受糖尿病患者青睞,市場需求量大。不過,目前在臨床應(yīng)用的速效胰島素藥物僅有門冬胰島素和賴脯胰島素等幾種,因而有必要開發(fā)

2、新型速效胰島素類似物和生產(chǎn)新途徑。近年來,利用植物系統(tǒng)表達(dá)藥用蛋白在降低生產(chǎn)成本、規(guī)?；a(chǎn)和安全性方面與傳統(tǒng)的大腸桿菌、酵母和轉(zhuǎn)基因動物表達(dá)系統(tǒng)相比具有優(yōu)勢。
　　基于此,本研究根據(jù)人胰島素氨基酸(GenBank. AAA59172)序列和小C肽(TYPGDVPK)序列,按植物(油菜)偏愛密碼子設(shè)計合成了198 bp編碼普通人胰島素原基因Des30。隨后以Des30為模板,用PCR突變技術(shù)擴增并創(chuàng)造了基因B26H、B28D和B2

3、6H-B28D,并構(gòu)建了4個原核表達(dá)載體: pET28a-Des30、pET28a-B26H、pET28a-B28D和pET28a-B26H-B28D。轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)后,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、用Ni-NTA親和柱純化、復(fù)性、胰島素體外成熟(酶解)和動物實驗驗證功能。取得了如下研究結(jié)果:1.基因設(shè)計合成與原核表達(dá)載體構(gòu)建:根據(jù)植物偏愛密碼子的原則設(shè)計并合成198 bp的普通人胰島素原基因Des

4、30,用PCR突變技術(shù)獲得基因B26H、B28D和B26H-B28D;將目的基因插入載體pET28a相應(yīng)位點,成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-Des30、pET28a-B26H、pET28a-B28D和pET28a-B26H-B28D;2.胰島素原類似物的誘導(dǎo)表達(dá)和純化:用終濃度1 mM的IPTG誘導(dǎo),4種胰島素原類似物均成功地在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá),并以包涵體形式存在;并用Ni-NTA純化介質(zhì)對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化;3.胰島

5、素原類似物的復(fù)性與酶切:純化的包涵體蛋白通過低溫透析復(fù)性,然后用胰蛋白酶和羧肽酶B酶切,Western-blot結(jié)果顯示,釋放出的單體胰島素與陽性對照一樣具有免疫活性,MALDI-TOF質(zhì)譜檢測結(jié)果表明,酶切產(chǎn)物分子量分別與預(yù)測的人胰島素類似物分子量一致。4.生物學(xué)活性檢測:小鼠血糖實驗數(shù)據(jù)表明,用大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的B26H-insulin、B28D-insulin和B26H-B28D-insulin與臨床常用的速效胰島素NovoRap