星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控未成熟腦神經(jīng)干細(xì)胞關(guān)鍵分子的篩選與初步驗(yàn)證.pdf

1、[目的]星形膠質(zhì)細(xì)胞作為神經(jīng)發(fā)生所必須的小生境中數(shù)量最豐富的細(xì)胞，可通過細(xì)胞間接觸和分泌可溶性因子調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。然而，目前對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生哪些因子參與調(diào)控以及何種因子在其中起重要作用知之甚少。本課題擬通過運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)與干預(yù)、定量蛋白組學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法等，篩選在神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵分子并加以驗(yàn)證。以期通過對(duì)關(guān)鍵分子的干預(yù)，探索促進(jìn)未成熟腦損傷修復(fù)的有效途徑，為臨床早產(chǎn)兒腦損傷的治療提供新的思路

2、。
　　[方法]首先建立新生1日齡大鼠腦紋狀體星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，分別采用適度的氧糖剝奪、適宜濃度的布雷福德菌素和氟代檸檬酸抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的分泌功能。通過采用BrdU/Nestin和Tuj1/Nestin免疫熒光雙染，觀察共培養(yǎng)下的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的改變，判斷星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。在成功建立細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)模型的基礎(chǔ)上，收集各組星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清，超濾濃縮后采用iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)方法和生物信息學(xué)

3、分析方法，鑒定不同處理組與對(duì)照組上清中差異表達(dá)的分泌蛋白，并從中篩選出可能發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵分子。對(duì)這些關(guān)鍵分子的作用通過已建立的細(xì)胞培養(yǎng)體系進(jìn)一步加以驗(yàn)證，探討其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的作用及其機(jī)制。
　　[結(jié)果]通過星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞非接觸狀態(tài)下共培養(yǎng)，我們證實(shí)了星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過分泌可溶性因子調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化。分別經(jīng)適度的氧糖剝奪、一定濃度的布雷福德菌素和氟代檸檬酸處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌功能被抑制，不再具有促進(jìn)神經(jīng)

4、干細(xì)胞增殖和分化的能力，體外細(xì)胞共培養(yǎng)和干預(yù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒ⅰ?br>　　采用iTRAQ標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)在星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中共鑒定出375個(gè)蛋白，通過三個(gè)相互互補(bǔ)的分泌蛋白預(yù)測(cè)方法，確認(rèn)其中有130個(gè)分泌蛋白，并且有44個(gè)蛋白系首次發(fā)現(xiàn)由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌產(chǎn)生的。通過Geneontology分析，發(fā)現(xiàn)在這130個(gè)蛋白中，分別有29個(gè)蛋白參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和凋亡，18個(gè)蛋白參與調(diào)控免疫、炎癥防御、神經(jīng)生理過程，29個(gè)蛋白屬于

5、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。運(yùn)用Proteinpilot軟件計(jì)算，顯示在氧糖剝奪、布雷福德菌素和氟代檸檬酸干預(yù)后分別有27、20、25個(gè)蛋白上調(diào)和33個(gè)、48個(gè)、27個(gè)蛋白下調(diào)；其中三個(gè)干預(yù)組共同上調(diào)的蛋白有4個(gè)，共同下調(diào)的蛋白有10個(gè)。
　　在共同變化蛋白中我們選取了4個(gè)變化最為顯著的(P<0.001)蛋白：Postn(下調(diào))、Psap(下調(diào))、Tpt1(上調(diào))和Ppia(上調(diào))進(jìn)行初步的功能驗(yàn)證。免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示這4種候選蛋白在星形

6、膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的濃度變化與iTRAQ蛋白組學(xué)檢測(cè)的結(jié)果一致。體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Postn蛋白在加入神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)體系3天起可顯著的促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖(P<0.05)。
　　[結(jié)論]1.星形膠質(zhì)細(xì)胞可以通過分泌可溶性因子影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化；2.星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的130種蛋白主要參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、神經(jīng)發(fā)育、免疫反應(yīng)、以及細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成和營(yíng)養(yǎng)支持功能；3.Postn蛋白在體外環(huán)境可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，可能