人未成熟和成熟NK細胞的分子特征及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò).pdf

1、自然殺傷細胞(Natural killer cells，NK cells)是固有免疫系統(tǒng)中最重要的組成部分，也參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答。NK細胞通過釋放細胞因子、趨化因子和細胞毒活性等方式在抵抗病毒和其他病原體感染早期以及殺傷腫瘤細胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。人的NK細胞由CD34+造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)發(fā)育而來，HSCs主要存在于骨髓中;臍血、外周血、胸腺、二級淋巴器官、肝臟以及蛻膜組織來源的HSCs

2、在體外實驗中也可以誘導(dǎo)出NK細胞，這表明NK細胞的終端分化不僅僅存在于骨髓中。NK細胞的發(fā)育成熟需要經(jīng)過一系列有序的階段，但我們對未成熟和成熟NK細胞的分子特征及轉(zhuǎn)錄調(diào)控知之甚少。目前，關(guān)于小鼠NK細胞研究報道較多，而對人NK細胞的全面理解尚未實現(xiàn)。
　　在人外周血中，NK細胞約占淋巴細胞總數(shù)的10％，在這些外周血NK細胞(peripheral NK，pNK)中有約95％為CD56dimCD16+成熟的NK細胞;與此不同的是，NK

3、細胞是正常妊娠期間蛻膜組織中占主導(dǎo)地位的淋巴細胞（約占淋巴細胞總數(shù)的70％），這些早孕蛻膜NK(decidual NK，dNK)細胞主要為CD56brightCD16-未成熟的NK細胞。為了進一步確認pNK細胞相對于dNK細胞更為成熟，我們分析了轉(zhuǎn)錄因子T-bet和ID2的表達。轉(zhuǎn)錄因子T-bet在最后階段調(diào)節(jié)小鼠NK細胞的終端成熟和功能;ID2表達于NK細胞的祖細胞，并調(diào)節(jié)其早期發(fā)育過程。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)，dNK細胞多為T-bet-

4、，而＞90％的pNK細胞呈現(xiàn)T-bet+的表型。免疫印跡分析表明，ID2在dNK細胞中的表達量高于pNK細胞。此外，我們還檢測了許多已報道的與NK細胞發(fā)育、成熟相關(guān)的標志分子的表達，與預(yù)想結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)dNK細胞高表達許多不成熟的標志分子(如CD27和CD94)，而pNK細胞則高表達許多成熟的標志分子（如CD57和CD11b）。綜上，我們的這些結(jié)果表明，dNK細胞相對于pNK細胞表現(xiàn)出相對未成熟的特征。
　　為了更好的發(fā)現(xiàn)人的

5、未成熟和成熟NK細胞的新的分子特征以及其轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，我們以外周血CD56+T細胞和CD3+CD56-T細胞作為對照，對純化的dNK、臍血NK(cord-blood NK cell，cNK)和pNK細胞進行了全基因組表達譜分析。通過高通量芯片以及熒光定量PCR和流式細胞術(shù)驗證的數(shù)據(jù)，我們對未成熟的早孕蛻膜NK(immature decidual NK，idNK，表型為CD56brightCD16-T-bet-)和相對成熟的外周血NK(m

6、ature peripheral NK，mpNK,表型為CD56dimCD16+T-bet+)細胞做了全面的比較分析。我們不僅研究了未成熟NK和成熟NK細胞之間的差異，還分析了NK細胞相對于T細胞所共有的分子。
　　首先，我們比較了idNK和mpNK細胞表面分子表達的差異，我們發(fā)現(xiàn)這些差異與它們各自的已知功能是一致的。idNK細胞表達更多的抑制性受體（例如NKG2A、CD158b和GITR），可能與它們的較弱的細胞毒活性和維持自身

7、耐受相關(guān);而mpNK細胞表達多種活化性受體和共刺激因子(例如CD2、CD8和CD226)，可能與它們對病原體感染的細胞和腫瘤細胞的強細胞毒活性相關(guān)。
　　其次，我們分析了生長因子、細胞因子、趨化因子以及這些分子的受體在idNK和mpNK細胞的表達水平的異同。我們發(fā)現(xiàn)，NK細胞可以分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein2，BMP2)、Jagged2和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)等多種

8、生長因子，而這些分子已經(jīng)被報道可以影響NK細胞的發(fā)育，這就說明這些分子除了以旁分泌的方式發(fā)揮作用外還可能以自分泌的方式影響NK細胞的發(fā)育或功能。此外，值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)，與mpNK細胞相比，idNK細胞表達很高水平的與破骨細胞和成骨細胞發(fā)生密切相關(guān)的生長因子（例如Tnfsf11、Tnfrsf11b、Spp1和Bmp2）。
　　再次，我們發(fā)現(xiàn)，idNK細胞內(nèi)很多趨化因子的mRNA（例如Xcl1、Cxcl1、Cxcl10和Cxcl

9、14）表達水平較高，這賦予idNK細胞更強的招募NK細胞自身或其他淋巴細胞的能力，例如招募未成熟的樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和中性粒細胞等。與idNK細胞富含趨化因子基因不同，mpNK細胞相對高表達多種趨化因子受體（例如CXCR4、CXCR2、CXCR1和CCR6），這表明mpNK細胞可能比idNK細胞具有更強的遷移能力。
　　緊接著，我們分析了不同NK細胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子表達譜。我們的研究描述了人類不同的NK

10、細胞亞群的轉(zhuǎn)錄因子，這些NK細胞亞群包括未成熟的NK細胞（dNK和CD56bright pNK細胞）和相對成熟的NK細胞（CD56dim pNK和CD34+HSCs體外誘導(dǎo)的NK細胞）。我們發(fā)現(xiàn)，idNK和mpNK細胞分別富含同源異形框家族的轉(zhuǎn)錄因子（例如Hoxa5、Hoxa9、Pbx1和Hop）和鋅指蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子（例如Klf9、Znf14、Znf483和Znf831）。我們推測idNK細胞高表達的同源異形框家族的轉(zhuǎn)錄因子可能有助

11、于維持其不成熟的細胞狀態(tài)，而mpNK細胞高表達的鋅指蛋白可能對其細胞毒活性非常重要。此外，通過與T細胞的比較分析，我們發(fā)現(xiàn)了許多新的可能調(diào)節(jié)NK細胞發(fā)育或功能的轉(zhuǎn)錄因子。迄今，小鼠NK細胞的轉(zhuǎn)錄因子相對明確，我們的研究發(fā)現(xiàn)許多小鼠模型發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子同樣也表達在人類的NK細胞中（例如Id2、Nfil3、Eomes、Mitf和Klf4）。除了確認了上述小鼠中已知的轉(zhuǎn)錄因子，我們還發(fā)現(xiàn)了許多新的轉(zhuǎn)錄因子可能參與調(diào)節(jié)NK細胞的發(fā)育和功能（例如E

12、tv5、Nfe2、Mycn、Nr2f2和Hoxa10）。
　　最后，根據(jù)我們的研究數(shù)據(jù)，并結(jié)合已有的報道以及生物信息學(xué)的分析結(jié)果，我們對針對性選擇的轉(zhuǎn)錄因子的靶基因進行了預(yù)測，并提出了一個NK細胞的自我調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們推斷，造血干細胞發(fā)育過程中，NK細胞自分泌和/或旁分泌細胞因子和趨化因子誘導(dǎo)或激活了轉(zhuǎn)錄因子，反過來，轉(zhuǎn)錄因子又可以激活或促進對NK細胞發(fā)育和成熟至關(guān)重要的分子的表達。這可能是成熟的具有功能的NK細胞產(chǎn)生的潛在機制。此

13、外，我們強調(diào)自分泌的BMP2和TGF-β2和它們所調(diào)節(jié)的細胞因子（如骨保護素/OPG，骨橋蛋白/OPN和多效生長因子/PTN）以及idNK細胞中富含的轉(zhuǎn)錄因子（如同源盒家族轉(zhuǎn)錄因子、CREB和MYCN）相互協(xié)調(diào)，相互作用，可能有助于維持idNK細胞的不成熟狀態(tài)。
　　我們的研究的創(chuàng)新之處和意義主要在于:
　　(1)我們發(fā)現(xiàn)了一些新的idNK細胞分泌的生長因子、細胞因子和趨化因子，這些分子可能以自分泌的方式在NK細胞發(fā)育的早期

14、及維持其不成熟的狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。有趣的是，這些生長因子包括6個（如護骨素和多效生長因子等）對骨形成和發(fā)育非常重要的分子，我們將NK細胞的功能拓展到一個全新的領(lǐng)域。
　　(2)我們首次描述了人的未成熟和成熟NK細胞的轉(zhuǎn)錄因子譜。我們發(fā)現(xiàn)，未成熟的蛻膜NK細胞富含同源異型盒家族的轉(zhuǎn)錄因子，可能有助于維持其不成熟的狀態(tài);成熟的外周血NK細胞富含鋅指蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，可能有助于發(fā)揮其細胞毒活性。
　　(3) NK細胞自分泌的生

15、長因子、細胞因子、趨化因子和其表達的轉(zhuǎn)錄因子相互作用，形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們的研究較為全面的描述了NK細胞的自我調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　(4)通過與T細胞綜合比較分析，我們發(fā)現(xiàn)了許多新的可能參與調(diào)控NK細胞發(fā)育、分化或功能轉(zhuǎn)錄因子。
　　總體而言，我們的研究從細胞發(fā)育和分化的角度對未成熟和成熟NK細胞進行了描述。我們較為詳細的分析了人NK細胞的表面受體、生長因子、細胞因子、趨化因子以及轉(zhuǎn)錄因子等分子特征并預(yù)測了NK細胞的自我調(diào)