超表達擬南芥miR319a對矮牽牛形態(tài)發(fā)育的影響.pdf

1、植物MicroRNAs(miRNAs)是一類長為21～25個核苷酸(nt)的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，植物miRNAs通過對靶基因mRNA的剪切或轉(zhuǎn)錄后抑制調(diào)控靶基因的表達，從而影響植物生長發(fā)育、細胞分化、細胞增殖和應(yīng)激反應(yīng)等多方面中起重要作用。擬南芥miR319基因家族有三個成員，miR319a、miR319b和miR319c，三個家族成員在序列上十分保守，但在功能上卻不盡相同。TCP是植物轉(zhuǎn)錄因子，具有一個TCP結(jié)構(gòu)域，根據(jù)該結(jié)構(gòu)域

2、特點將TCP基因分為兩類:ClassⅠ(PCF)和ClassⅡ(TCP-C)，ClassⅡ又分為兩類CYC/TB1和CIN亞類，其中CIN亞類基因部分成員被證實是miR319的靶基因，TCP基因家族主要參與調(diào)控植株的分枝及調(diào)控葉片的發(fā)育等。
　　矮牽牛(Petunia hybrida Vilm.)屬于茄科矮牽牛屬的雙子葉植物，是重要的園藝觀花植物。因易培養(yǎng)、遺傳背景清晰和農(nóng)桿菌易轉(zhuǎn)化等優(yōu)點，現(xiàn)已成為轉(zhuǎn)基因研究的模式植物。目前，mi

3、RNA對矮牽牛的調(diào)控作用研究甚少，本文以矮牽牛(Mitchell Diploid, MD)為試驗材料，將擬南芥miR319a基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，從形態(tài)、分子水平和解剖等分析該基因異位表達對植物生長發(fā)育的影響及其對矮牽牛PhTCP5和PhTCP6基因調(diào)控作用。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1.矮牽牛PhTCP5和PhTCP6基因全長的克隆
　　根據(jù)矮牽牛已知序列s3和c7-3設(shè)計特異引物，提取矮牽?；蚪MDNA和總RNA作為模板

4、，利用RACE結(jié)合hi-TAIL技術(shù)克隆基因的全長，分別命名為PhTCP5和PhTCP6，基因登錄號分別為KC297683和KJ175239，進化樹分析得知PhTCP5和PhTCP6都屬于CIN支。
　　2.矮牽牛PhTCP5和PhTCP6基因的組織表達分析
　　利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析PhTCP5和PhTCP6基因在矮牽牛野生型不同組織中的表達情況，得出PhTCP5基因在葉中表達量最高，其次是腋芽(＜0

5、.5cm)，最后依次是花、根、莖;PhTCP6基因在腋芽(＜0.5cm)中表達量最高，葉、花蕾的表達量高于根，莖中只有少量表達，推測矮牽牛PhTCP5和Ph TCP6基因可能參與調(diào)控葉和側(cè)枝的發(fā)育。
　　3.AtmiR319a基因在矮牽牛中的超量表達研究
　　將含有目的基因AtmiR319a的質(zhì)粒pRS300連接到表達載體PG523中，構(gòu)建植物超表達載體（命名為:PG605）。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將超表達載體PG605

6、轉(zhuǎn)入矮牽牛中，最終獲得轉(zhuǎn)基因植株16株，DNA分子水平檢測證明全部均為陽性植株，轉(zhuǎn)基因植株的葉片和花形態(tài)表型發(fā)生劇烈變化，具體表型如下:
　　AtmiR319a基因在矮牽牛中過量表達時，(1)葉發(fā)育上，轉(zhuǎn)基因植株的葉片向背卷曲，葉片凹凸不平，葉片兩側(cè)不對稱，葉脈的主脈不顯著，側(cè)脈模式紊亂，葉表皮細胞變小，形狀不規(guī)則;(2)花發(fā)育上，轉(zhuǎn)基因的花冠變小，花瓣頂端變尖且向背卷曲，花冠深裂、花瓣間重疊，花眼顏色加深、喉管筒直徑變大;(3)

7、株型發(fā)育上，轉(zhuǎn)基因植株的節(jié)間距縮短，植株變矮，植株分支增多。
　　4.miR319對靶基因PhTCP5和PhTCP6的作用方式
　　用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR319與靶基因互補配對發(fā)現(xiàn)，miR319與PhTCP5配對位置在1233∶1253堿基之間，miR319與PhTCP6配對位置在1884∶1904堿基之間，利用RNA連接酶介導(dǎo)的5'-RACE（RLM-5'-RACE）驗證miR319對靶基因Ph TCP5和PhTCP6

8、剪切的精確位點都位于miR319的5'-端第10-11個堿基之間。熒光實時定量PCR(qRT-PCR)分析發(fā)現(xiàn)在野生型和AtmiR319a轉(zhuǎn)基因T1代植株6葉期的腋芽(＜0.5cm)中，PhTCP5和PhTCP6基因在轉(zhuǎn)基因中的表達水平顯著下調(diào)，說明AtmiR319a負調(diào)控矮牽牛Ph TCP5和PhTCP6基因的表達。
　　5.抗miR319剪切的PhTCP5和PhTCP6突變基因的表達研究
　　根據(jù)miR319與PhTCP

9、5和PhTCP6靶序列特點，分別設(shè)計兩對特異引物用來突變靶基因的堿基，PhTCP5突變7個堿基，PhTCP6突變6個堿基，除了PhTCP5突變的第一堿基不同外，其他突變位點和突變堿基數(shù)相同。mPhTCP5和mPhTCP6連接在pGMF500載體上，不同的是mPhTCP6采用的是自身啟動子，轉(zhuǎn)化矮牽牛發(fā)現(xiàn)mPhTCP5突變使得轉(zhuǎn)基因植株比野生矮，主枝生長不明顯，側(cè)枝生長茂盛，葉片較野生型小， mPhTCP6轉(zhuǎn)基因植株在株型和葉片的變化上與