MIGS技術(shù)在矮牽牛上的應(yīng)用.pdf

1、基因沉默技術(shù)作為研究基因功能的重要工具之一，在植物分子生物學(xué)研究和遺傳改良等方面得到廣泛應(yīng)用。自基因沉默現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)以來，多種基因沉默技術(shù)相繼建立，包括共抑制、反義RNA、hpRNAi和VIGS等，然而，這些方法都有其局限性。MIGS沉默技術(shù)作為一種新的植物基因沉默技術(shù)，在基因沉默的高效性方面有了很大改進(jìn)。MIGS沉默技術(shù)利用擬南芥miR173介導(dǎo)產(chǎn)生一系列tasiRNA，tasiRNA數(shù)量巨大，與靶基因互補(bǔ)發(fā)揮沉默效應(yīng)，MIGS沉默技術(shù)調(diào)

2、控的效率具有優(yōu)勢。
　　目前，MIGS沉默技術(shù)在矮牽牛上的應(yīng)用尚未見報(bào)道。通過該沉默技術(shù)對矮牽牛的八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和查爾酮合成酶基因(CHS)進(jìn)行沉默實(shí)驗(yàn)，并分析該沉默技術(shù)在矮牽牛上沉默效應(yīng)。以綠色愈傷組織失綠，花顏色發(fā)生變化作為標(biāo)記，表型變化易于觀察，可以對基因沉默載體的效果進(jìn)行快速評價(jià)，有利于節(jié)省時(shí)間，提高工作效率，并且可以為利用MIGS沉默技術(shù)研究矮牽牛相關(guān)基因的功能奠定基礎(chǔ)。此外，該技術(shù)還可以用于對矮牽牛的

3、性狀進(jìn)行改造，為矮牽牛品種改良提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)，因此本實(shí)驗(yàn)具有重要的研究意義。獲得的結(jié)果如下:
　　1、MIGS沉默技術(shù)在矮牽牛上的研究
　　以pGREEN雙元載體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，構(gòu)建在矮牽牛上應(yīng)用的MIGS沉默載體。MIGS沉默載體包括:miR173基因，帶有miR173靶位點(diǎn)的目的基因片段、報(bào)告基因。在設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增目的基因序列的引物時(shí)，將上游引物5'端額外加上與miR173互補(bǔ)的序列，擴(kuò)增出的目的基因片段就帶有了miR1

4、73的靶位點(diǎn)，從而在轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)使miR173與連接在目的基因序列5'端的靶序列互補(bǔ)結(jié)合行使功能。
　　2、TA克隆在MIGS沉默載體構(gòu)建上的應(yīng)用
　　在擬表達(dá)目的片段啟動子和終止子序列之間引入兩個(gè)XcmI酶切位點(diǎn)，得到MIGS沉默基礎(chǔ)表達(dá)載體pMIGS-T。以pMIGS-T為基礎(chǔ)構(gòu)建基因沉默植物表達(dá)載體時(shí)，可直接將目的基因PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物與XcmI單酶切后的pMIGS-T載體相連，選擇正向的連接產(chǎn)物，即完成植物表達(dá)載體的構(gòu)

5、建。大大縮短構(gòu)建過程，節(jié)省人力物力。
　　3、矮牽牛PhPDS基因的克隆
　　根據(jù)對矮牽牛PDS基因EST序列進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)引物。通過RACE技術(shù)克隆得到矮牽牛PDS基因的cDNA全長序列，將其命名為PhPDS(GenBank accessionnumber: KP677483)。該基因全長1749bp，編碼583個(gè)氨基酸。矮牽牛中PDS基因的克隆可以為驗(yàn)證MIGS沉默技術(shù)在矮牽牛中的應(yīng)用，提供一個(gè)直觀快捷的內(nèi)源檢測報(bào)告基

6、因，并為研究矮牽牛PhPDS基因的進(jìn)化提供了依據(jù)。通過半定量RT-PCR反應(yīng)檢測矮牽牛PhPDS基因在矮牽牛MD不同組織中的表達(dá)情況，PhPDS基因有較高的組織表達(dá)特異性，在6葉期的莖和葉中表達(dá)量最高，根中表達(dá)量較低，在成熟期的花中也有少量表達(dá)，預(yù)測矮牽牛PhPDS基因可能參與植物生長發(fā)育的調(diào)控。
　　4、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
　　選取矮牽牛八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)和查爾酮合成酶基因(CHS)做為靶基因，利用miR17

7、3誘導(dǎo)的基因沉默(MIGS)技術(shù)體系改變矮牽牛的顏色和花色性狀，使轉(zhuǎn)基因植株的表型變化更加容易觀察。將目的基因序列連接到表達(dá)載體pMIGS-T中，構(gòu)建植物MIGS沉默載體。分別將重組質(zhì)粒利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入矮牽牛MD品系和地毯品系中，通過一系列的抗性篩選及DNA水平檢測，篩選出轉(zhuǎn)基因矮牽牛植株。對轉(zhuǎn)基因矮牽牛進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn)沉默PhPDS基因的矮牽牛接種大約2周后，開始出現(xiàn)白色的愈傷，沉默CHS基因的矮牽牛轉(zhuǎn)基因植株花瓣褪色，由紫色花變成

8、了白色花，由此證明MIGS沉默技術(shù)體系能夠在矮牽牛中應(yīng)用。
　　5、MIGS技術(shù)對矮牽牛的沉默效應(yīng)
　　提取表型變化明顯的轉(zhuǎn)基因植株RNA，對轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平檢測，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株中CHS，PDS基因的表達(dá)量顯著減少;通過RACE技術(shù)對CHS，PDS基因的剪切進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CHS，PDS基因被剪切的位點(diǎn)較多，這與miR173可以介導(dǎo)產(chǎn)生一系列發(fā)揮沉默效應(yīng)的tasiRNA結(jié)果一致，對small RNA進(jìn)行測定，分析沉默的效