不同DFR基因轉化矮牽牛研究.pdf

1、高等植物的花色主要受花色素控制,花色素主要由類黃酮、類胡蘿卜素、生物堿三類物質組成,其中類黃酮包括原花青素、花青素苷、查爾酮等12類。在花青素苷合成途徑中二氫黃酮醇-4-還原酶(DFR)對花色素苷的最終形成起決定性作用。矮牽牛DFR主要催化DHM生成無色飛燕草素,對DHQ也有作用,而不能催化DHK,致使不存在天竺葵素的積累。小花矮牽牛是矮牽牛的同科近緣種,由于小花矮牽牛與矮牽牛親緣關系較近,DFR基因轉入更有希望改變矮牽?；ㄉ?br>

2、　　本研究克隆了2個不同花色矮牽牛株系的DFR,全長均為1473 bp,最大開放讀碼框為1143bp,編碼380個氨基酸。與NCBI公布的DFR-A相似性分別為93.8和99.6％,翻譯后的氨基酸組成相似性為98.2%和100%,驗證了矮牽牛DFR屬Asp型。實時熒光PCR相對定量測定表明矮牽牛DFR在葉片中幾乎無表達,在初開花瓣中表達量最大,而盛開花瓣中略有下降,花藥中有極高的表達活性;除花藥以外,DFR酶活性變化規(guī)律與表達基本一致,

3、兩者存在線性相關性。內源DFR酶活性在不同株系中表現差異較大,其中‘W115’中僅有較低酶活性,而‘Lx’中酶活性最大,‘2512’和‘9702’中的酶活性較接近,約為‘Lx’的1/10。UPLC測定中僅在‘9702’中檢測到矢車菊素-3-葡萄糖苷及飛燕草素存在。
　　通過RACE技術獲得小花矮牽牛DFR cDNA序列,生物信息學分析發(fā)現CaDFR屬于Asp型,第145位是谷氨酸。同時構建了小花矮牽牛、番茄、月季、非洲菊DFR基因

4、的CaMV35S啟動子正向表達載體,通過根癌農桿菌LBA4404對4個矮牽牛株系進行轉化,以50mg/L卡那霉素為矮牽牛的篩選濃度。經PCR檢測約57%抗性苗為陽性株,Southern雜交證實分別轉入了1~5拷貝的外源基因。
　　T0代花色改變明顯,其中‘LH26’一個分枝花色不變,另一分枝則為白花帶紫斑,‘LR25’為紫紅色花,‘9R9’、‘9H33’花藥變紫,花色為深紅色,‘9T19’、‘9H31’花色為粉紅相間的雜斑花,‘9

5、R8’、‘9H30’紅色花瓣帶粉斑,‘9R12’花顏色加深同時在邊緣出現一圈斑紋,‘9T18’則完全變?yōu)榉凵ā?1株‘WR’為粉色花,而且從花蕾幼期直到開花全過程中均為粉色,‘WR13’開出了一半白色一半粉色的花。
　　對‘9H33’和‘9R9’的表達分析表明,外源DFR基因在矮牽牛中的表達遠高于內源基因,最高可達64倍,在初開花瓣中都有相對高的表達,但峰值出現的時間因基因不同而有差異。
　　不同來源的DFR在矮牽牛中的表

6、達對酶活性影響不同。外源DFR基因的轉入,可明顯提高酶活性,同時使酶的合成提前,分別在初開花瓣或盛開花瓣中達到最高峰。DFR酶活性與顏色存在較大相關性,顏色越深酶活性越高,且紫色株系較紅色株系具更高的酶活性。
　　花青素苷的UPLC檢測證實顏色加深的轉化子‘9R9’、‘9H33’、‘9R12’在矢車菊素-3-葡萄糖苷含量大幅增加的同時,出現天竺葵素-3-葡萄糖苷吸收峰。在‘9702’轉化子中,DFR酶活性與花青素苷含量呈現出正相關