蠟梅(Chimonanthus praecox)金屬硫蛋白基因分子特征分析及在矮牽牛中的超表達(dá)效應(yīng)的初步分析.pdf

1、金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一類富含Cys、能夠結(jié)合重金屬的低分子量蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物界。MT在提高植物重金屬抗性、解除對Cu、Zn、Pb、Ag、Hg、cd等重金屬毒性方面具有重要作用，多數(shù)MT在C端和N端有兩個(gè)富含Cys的結(jié)構(gòu)域，其中的巰基既可以與重金屬離子螯合形成無毒或低毒的絡(luò)合物，還可以與重金屬等脅迫條件誘發(fā)產(chǎn)生的·OH發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而降低氧化損傷。大量研究表明，植物金屬硫蛋白可以通過其大量的Cy

2、s殘基螯合重金屬并清除活性氧，使植物免受氧化損傷。近年來從植物中克隆到許多編碼金屬硫蛋白的基因，并在研究基因表達(dá)模式、組織表達(dá)特異性以及基因結(jié)構(gòu)，如啟動(dòng)子、內(nèi)含子在染色體上的定位等方面取得了一定進(jìn)展，但對其功能的研究還處于起步階段。從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的臘梅花cDNA文庫中，利用EST技術(shù)從臘梅中克隆了金屬硫蛋白基因。通過生物信息學(xué)手段，對基因序列進(jìn)行了分析和功能預(yù)測。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其可能的功能，構(gòu)建了一個(gè)植物表達(dá)載體，通過矮牽牛的轉(zhuǎn)化獲得了

3、一批轉(zhuǎn)基因植株，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了初步分析，主要研究結(jié)果如下： 1．metallothionein及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 利用DNAStar，DNAMAN等軟件分析克隆基因的序列，分析表明該cDNA序列長1083bp，其中ORF240bp，編碼79個(gè)氨基酸，該蛋白質(zhì)的理論分子量為7.76kD，等電點(diǎn)為4.67。在NCBI上進(jìn)行BLASTP比對，共有15條氨基酸序列與其有較高的同源性，排在第一位的是丹參中的puta

4、tive metallothionin2a蛋白質(zhì)，相似性達(dá)96.7％。 2．表達(dá)載體的構(gòu)建 metallothionein基因位于文庫克隆載體pTriplEx2上，活化菌液并用限制性內(nèi)切酶SfiI酶切，同時(shí)酶切添加了SfiI酶切位點(diǎn)的環(huán)狀pMD-18TM，回收目的片段和載體并連接，經(jīng)過酶切和PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建克隆載體；再用XbaI和SmaI分別雙酶切克隆載體和表達(dá)載體pC2301，回收目的片段和表達(dá)載體并連接，經(jīng)酶切

5、和PCR驗(yàn)證，成功構(gòu)建含有目的基因的表達(dá)載體。 3．根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化和Km+抗性矮牽牛植株的獲得 采用根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將外源目的基因?qū)氚珷颗?，得到?8株Km+再生植株。 4．轉(zhuǎn)基因矮牽牛的分子生物學(xué)鑒定 首先對篩選到的抗性植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢測，初步篩選并確定轉(zhuǎn)化植株。然后對GUS染色呈陽性植株再進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明GUS陽性株系均出現(xiàn)一條與陽性對照相同的特異帶，而非轉(zhuǎn)