尿胱氨酸分析方法的研究及應(yīng)用.pdf

1、尿石癥是泌尿科常見(jiàn)疾病，病因非常復(fù)雜。它與自然環(huán)境、社會(huì)條件、全身新陳代謂十紊亂及泌尿系統(tǒng)本身的疾患有關(guān)。目前按結(jié)石的成分可分為草酸鈣結(jié)石、磷酸鈣結(jié)石、磷酸鎂銨結(jié)石、尿酸結(jié)石和胱氨酸結(jié)石。其中胱氨酸結(jié)石占所有腎結(jié)石的1％～3％，由尿中胱氨酸過(guò)飽和所致。胱氨酸結(jié)石具有不易溶解、質(zhì)地較硬，且容易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，一旦結(jié)石形成多需手術(shù)治療，創(chuàng)傷較大。準(zhǔn)確地定量尿液中的胱氨酸可以及時(shí)采取必要的預(yù)防措施，有效地阻止胱氨酸結(jié)石的形成。 本文在以下

2、三個(gè)方面進(jìn)行了研究：(1)胱氨酸可由兩個(gè)半胱氨酸氧化生成，在測(cè)定胱氨酸時(shí)，如果不加入巰基保護(hù)劑，半胱氨酸極易自氧化為胱氨酸對(duì)胱氨酸測(cè)定造成干擾。本實(shí)驗(yàn)用丙烯腈作為巰基保護(hù)劑，建立了準(zhǔn)確測(cè)定胱氨酸的方法，有效去除半胱氨酸對(duì)胱氨酸分離定量的影響，比較了丙烯腈和文獻(xiàn)報(bào)道的碘乙酸作為巰基保護(hù)劑的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果顯示用丙烯腈作為巰基保護(hù)劑的方法更簡(jiǎn)便、省時(shí)；(2)生物樣本(尿)中胱氨酸含量的測(cè)定，考察了胱氨酸量與疾病的關(guān)聯(lián)；(3)對(duì)尿生物樣本中胱氨

3、酸的提取方法進(jìn)行研究；首次嘗試用納米纖維提取胱氨酸。論文主要工作如下： 一、建立柱前衍生化-高效液相色譜法測(cè)定胱氨酸的方法及其評(píng)價(jià) 胱氨酸本身不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法直接檢測(cè)，因此選用柱前衍生試劑-丹酰氯，先將胱氨酸衍生為具有較強(qiáng)紫外和熒光吸收的衍生物，通過(guò)測(cè)定胱氨酸衍生產(chǎn)物的紫外吸收對(duì)胱氨酸進(jìn)行定量分析。但尿液中的半胱氨酸在衍生化過(guò)程中極易自氧化為胱氨酸，對(duì)胱氨酸準(zhǔn)確定量造成干擾。 本文建立了準(zhǔn)確測(cè)定尿液中胱

4、氨酸的高效液相色譜法。采用丙烯腈作為巰基保護(hù)劑保護(hù)半胱氨酸巰基，消除半胱氨酸對(duì)胱氨酸定量測(cè)定的干擾。色譜柱為KromasilC<,18>(4.6×250mm,5um)，丹酰氯為柱前衍生試劑，流速為1ml/min，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。胱氨酸在1mg/L～500mg/L范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好(r=0.9992)，本方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于尿液中胱氨酸的測(cè)定。 二、尿液中胱氨酸含量與年齡、疾病嚴(yán)重程度相關(guān)性初步研究 用建立的方法

5、測(cè)定了正常人和胱氨酸結(jié)石患者尿液中的胱氨酸含量，正常人測(cè)定結(jié)果在7.84～10.1μg/mL(9 mg/d～13 mg/d，3710～4776μmol/M肌酐)，與文獻(xiàn)報(bào)道的小于20mg/d相符合。測(cè)定了四例胱氨酸結(jié)石患者的尿胱氨酸含量，24小時(shí)胱氨酸總量分別為72.98mg，801.5mg，874.6和1093.2mg。胱氨酸濃度顯示了與年齡、疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性。 三、生物樣本中目標(biāo)物前處理方法的研究 以聚苯乙烯(P

6、S 10％)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA 4％)、PS-NH<,2>、PMMA-NH<,2>、PS-Cu、PS-COOH電紡納米纖維為萃取介質(zhì)，填裝固相微萃取小柱，提取尿液中的胱氨酸，提取回收效率最高可達(dá)54％，實(shí)驗(yàn)采用流動(dòng)注射、鄰苯二甲醛衍生、HPLC-Flu法摸索條件，確立最佳條件后，用丹酰氯衍生、HPLC-UV法分離測(cè)定胱氨酸。 以上各種納米纖維填充小柱對(duì)胱氨酸的提取效率還不十分理想，推測(cè)因?yàn)殡装彼釣闃O性分子，其與水的親和

7、性大于與固相介質(zhì)的親和性，為了進(jìn)一步了解納米纖維填充小柱提取作用機(jī)理，本文選取一種弱極性的藥物維拉帕米作為模型分子，以電紡納米纖維為萃取介質(zhì)，填裝固相微萃取小柱，從生物樣本中提取該藥物分子，從水中提取維拉帕米的提取回收率可達(dá)100％左右，血漿中提取回收率可達(dá)88.1％，該結(jié)果驗(yàn)證了本文對(duì)納米纖維固相萃取機(jī)理的假設(shè)與猜想，要提高目標(biāo)物的萃取效率，必須以相似相溶原理為基礎(chǔ)，在納米纖維上修飾對(duì)目標(biāo)分子親和的官能團(tuán)，增加目標(biāo)物在固-液兩相間的分