衛(wèi)生害蟲蛻皮激素類似物殺蟲劑篩選模型的建立.pdf

1、研究背景：昆蟲的生長發(fā)育是通過定期的蛻皮實現(xiàn)的，蛻皮過程是在甾醇、保幼激素、20-羥基蛻皮激素(20-hydroxyecdysone，20E)等幾種昆蟲激素的調(diào)節(jié)下完成的。20E的受體是種核受體，由蛻皮激素受體(ecdysone receptor，EcR)及超螺旋蛋白(ultraspiracle protein，USP)組成，在20E的誘導下EcR與USP結(jié)合形成二聚體時，只有EcR/USP二聚體才能與位于蛻皮激素可誘導基因啟動子區(qū)的蛻

2、皮激素響應(yīng)元件(ecdysone response element，EcRE)相結(jié)合而啟動早期基因的轉(zhuǎn)錄。如果這種激素依賴性的生化代謝的任何步驟受到干擾，都可能導致靶昆蟲的死亡或生長發(fā)育異常。目前，已有20多種昆蟲的EcR和(或)USP被克隆，其中EcR具有種類和種群的特異性，而EcRE的結(jié)構(gòu)則以黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的小分子熱休克蛋白基因啟動子(Hsp27-promoter)最為典型。目前第一、二代

3、殺蟲劑環(huán)境危害性弊端突顯，而昆蟲抗藥性則是第三代殺蟲劑面臨的主要問題，開發(fā)多種殺蟲劑循環(huán)，聯(lián)合使用則是減少害蟲抗藥性產(chǎn)生的首要途徑，所以建立能夠高效篩選新型殺蟲劑的高通量篩選模型迫在眉睫，Hien TT等<'[7]>在酵母中建立了一個針對云杉色卷蛾(Chortoneura fumiferana，Cf)EcR的配體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活(transactivation)系統(tǒng)，應(yīng)用果蠅Hsp27啟動子序列上的響應(yīng)元件EcRE(23bp)，連接上CYC

4、l(iso-1-cytochrome C)啟動子，在CfEcR及CfUSP同時存在時，在沒有配體存在的情況下，EcR與USP也可自發(fā)形成二聚體使報告基因強烈表達。因而我們可以在酵母體內(nèi)組成型表達衛(wèi)生害蟲的EcR及USP，用EcR/USP二聚體啟動果蠅EcRE-Hsp27啟動子，使得昆蟲蛻皮調(diào)節(jié)通路關(guān)鍵調(diào)節(jié)階段在酵母中重現(xiàn)，并且在啟動子后連接綠色熒光蛋GFP報告基因，利用這個模型來篩選作用于調(diào)節(jié)通路的藥物，進而開發(fā)出活性高、專一性強、對人

5、畜安全、在生物體內(nèi)易降解的新型生物殺蟲劑。目的：建立衛(wèi)生害蟲蛻皮激素類似物殺蟲劑篩選模型，通過此構(gòu)建的酵母模型篩選昆蟲蛻皮激素受體結(jié)合調(diào)節(jié)劑，然后利用篩出的藥物作用于衛(wèi)生害蟲，進而開發(fā)出活性高、專一性強、對人畜安全、在生物體內(nèi)易降解的新型生物殺蟲劑。 方法：人工合成白紋伊蚊(Aedes albopictus)EcR和USP的編碼序列，兩個基因以雙表達盒形式亞克隆入表達質(zhì)粒pGAP-Z，并整合到畢赤酵母(Pichiapastori

6、s)的染色體上使 EcR與USP在酵母中組成型表達，構(gòu)建成酵母A。人工合成果蠅EcRE，從果蠅基因組DNA中擴出Hsp27-promoter序列，再接上綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)報告基因，將：EcRE-Hsp27promoter-GFP片段亞克隆入pPIC3.5k，并整合到畢赤酵母A染色體的另一位點上(pGAP-Z與pPIC3.5k與畢赤酵母染色體的整合位點不同)，從而構(gòu)建成酵母模型(酵

7、母B)，通過施加蛻皮激素類似物二芳酰肼類農(nóng)藥蟲酰肼驗證酵母模型的敏感性，并初步使用酵母模型篩選一部分放線菌分泌物。 結(jié)果：成功的構(gòu)建了酵母表達質(zhì)粒pGAP-Z-TEF-USP-CYC-EcR、pPIC3.5K-ECRE-Hsp-GFP，轉(zhuǎn)化后的酵母模型在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證明EcR、USP在酵母中成功表達，兩者結(jié)合形成的 EcR/USP二聚體作用于EcRE啟動報告基因表達熒光蛋白。施加藥物蟲酰肼后模型酵母熒光強亮度遠低于