淫羊藿甙對MC3T3-E1細胞Smad1,4,5作用的實驗研究.pdf

1、目的：研究淫羊藿甙(icariin，ICA)對體外培養(yǎng)的成骨樣細胞MC3T3-E1中Smad1，4，5mRNA及蛋白的影響，探討ICA刺激成骨細胞生長、分化的分子機制。
　　方法：DMEM高糖、胎牛血清培養(yǎng)下的MC3T3-E1細胞按ICA刺激濃度0、10-9、10-8及10-7M分為四組，以1×105個/孔濃度種植。給藥后24、48及72h分別檢測細胞OD值；RT-PCR技術測定Smad1、Smad4、Smad5mRNA的量，用W

2、esternblot蛋白印跡方法評價Smad1、Smad4、Smad5蛋白的表達；利用速率法測定ALP活性，計算ALP濃度；經(jīng)ICA刺激的MC3T3-E1細胞培養(yǎng)21d后，利用Von Kossa's礦化結節(jié)染色法處理各濃度組，觀察染色結果。
　　結果：24hrs時，ICA各濃度組Smad1、Smad4、Smad5 mRNA表達水平無統(tǒng)計學意義，P值>0.05(Smad1：F=0.064，P=0.961；Smad5：F=1.216，

3、P=0.351，；Smad4：F=0.051，P=0.022)。48、72hrs時，ICA10-9M、10-8M、10-7M濃度組Smad1、Smad5 mRNA表達水平較0M組明顯上調，P值<0.05，具有統(tǒng)計學意義(48hrs：Smad1，F(xiàn)=332.435，P=0.000；Smad5，F(xiàn)=373.487，P=0.000；72hrs：Smad1，F(xiàn)=132.356，P=0.000；Smad5，F(xiàn)=102.384，P=0.000)。而

4、smad4在48h時，各濃度組均較24h時表達增強，并且在10-8M時差異明顯，具有統(tǒng)計學意義(F=131.654，P=0.000)。至72hrs時，ICA10-9、10-8、10-7M各組，以10-8M組對Smad1、Smad4、Smad5mRNA的上調作用最為顯著(P值均<0.05，圖表2-c、3-c)。Western blot蛋白印跡顯示24、48hrs時，ICA各濃度組Smad1蛋白表達水平無統(tǒng)計學意義，P值>0.05(24hr

5、s：F=0.749，P=0.559；48hrs：F=2.653，P=0.136)，72hrs時，ICA10-9、10-8、10-7M各組蛋白表達水平較0M組明顯增加，P值<0.05(F=16.985，P=0.001)，具有統(tǒng)計學意義；Smad5蛋白表達在ICA10-9、10-8、10-7M組分別于24、48、72hrs發(fā)現(xiàn)均較0M組上調，其中48hrs、72hrs表達增量明顯，P值<0.05，具有統(tǒng)計學意義(24hrs：F=3.762，

6、P=0.060；48hrs：F=14.579，P=0.001；72hrs：F=27.762，P=0.000)；ICA有效刺激組較對照組Smad5蛋白的表達于24hr時即出現(xiàn)差異性，Smad1及Smad4表達的差異性出現(xiàn)于72hrs，相對于48hrs以后出現(xiàn)表達差異的Smad1 mRNA、Smad4 mRNA、Smad5 mRNA而言，蛋白的表達并非平行于Smad1、Smad4、Smad5基因的表達，提示ICA對Smad1、4及5信號的轉

7、錄后水平的調控；至72hrs時，ICA10-9、10-8、10-7M各組，以10-8M組對Smad1、Smad4、Smad5蛋白的上調作用最為顯著(P值均<0.05)。細胞ALP活性檢測結果顯示MC3T3-E1細胞在淫羊藿甙的刺激下產(chǎn)生ALP的時間依賴性：各組在培養(yǎng)后的3d內，隨著時間的增加，LAP產(chǎn)生的總量增加。培養(yǎng)1d時，各組ALP值之間比較差異無統(tǒng)計學意義；培養(yǎng)2d時，10-9、10-8M組ALP值明顯高于0、10-7M組(P<0

8、.01).10-9、10-8M組間、0、10-7M組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.5).培養(yǎng)3d時，各組ALP值由高到低排列依次為10-8、10-9、0、10-7M.各組均值之間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01).ICA對MC3T3-E1細胞鈣結節(jié)檢測的染色結果顯示，細胞在淫羊藿甙刺激下培養(yǎng)21d后，Von Kossa’s礦化結節(jié)染色法處理各濃度組細胞，鈣結節(jié)增加從高到低依次為10-8、10-9、0、10-7M。
　　結論：I