木豆中產(chǎn)牡荊苷內(nèi)生真菌的分離鑒定及其對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖作用研究.pdf

1、內(nèi)生真菌是生活于健康植物的各種組織和器官中，能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化合物，其次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)繁多，生物活性各異，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、工業(yè)等領(lǐng)域表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
　　木豆為豆科木豆屬植物，具有豐富的藥理活性，黃酮類(lèi)和芪類(lèi)是其主要活性成分，從木豆當(dāng)中分離獲得的活性成分在抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化及抗菌等方面都具有非常重要的作用。
　　牡荊苷(Vitexin)，是存在于木豆中的一類(lèi)重要的黃酮類(lèi)物質(zhì)，臨床上用于治療心腦血管

2、疾病，對(duì)缺血性心肌損傷具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)理是增加冠狀動(dòng)脈的血流量、降低射血阻力及血漿粘度、提高RBC的變性能力、抑制血栓形成。本課題主要進(jìn)行木豆產(chǎn)牡荊苷內(nèi)生真菌的分離鑒定及其對(duì)促進(jìn)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖作用的研究。研究結(jié)果如下:
　　1.以木豆根、莖、葉為材料，將已消毒的植物材料接種至PDA上進(jìn)行分離培養(yǎng)，傳代和純化，最終獲得純化菌株154株，其中從根中獲得76株;從莖中獲得15株;從葉中獲得63株，均在PDA斜面試管

3、，4度保存。
　　2.參照《真菌鑒定手冊(cè)》和分子生物學(xué)方法鑒定，根據(jù)木豆內(nèi)生真菌不同形態(tài)，將分離得到的154株木豆內(nèi)生真菌進(jìn)行分類(lèi)，大致分為:鐮刀菌屬(Fusarium sp.)，毛殼菌屬(Chaetomium sp.)，附球孢屬(Epicoccum sp.)，節(jié)菱孢屬(Arthrinium sp.)，刺毛霉屬(Actinomucor sp.)，鏈格孢屬(Alternaria sp.)等。
　　3.運(yùn)用HPLC-UV和LC-

4、MS/MS方法，確定了木豆產(chǎn)牡荊苷內(nèi)生真菌的檢測(cè)條件，色譜條件為:色譜柱:HiQ sil C18W(4.6 mmψ×250 mm，5μm);流動(dòng)相為乙腈∶1％乙酸水溶液=20∶80(v/v);檢測(cè)波長(zhǎng):332 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣量:15μL。通過(guò)HPLC技術(shù)分析與檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩株產(chǎn)牡荊苷的內(nèi)生真菌，分別是鐮刀菌屬(Fusarium sp.)的G6和毛殼屬(Chaetomium sp.)的Y3。
　　4.利用單因素-響

5、應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)方法對(duì)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的種類(lèi)、組分、初始pH值及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以G6菌株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，考察了影響內(nèi)生真菌牡荊苷產(chǎn)量的主要因素，包括不同種類(lèi)培養(yǎng)基、碳源濃度、氮源濃度、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基初始pH值等。確定了最佳的木豆內(nèi)生真菌G6菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件:培養(yǎng)基為PDB液體培養(yǎng)基、添加2％的葡萄糖為碳源、添加1％的硫酸銨為氮源、培養(yǎng)基初始pH值為5、培養(yǎng)時(shí)間為6天、培養(yǎng)溫度為28℃，該條件下培養(yǎng)G6獲得牡荊苷的量達(dá)到18.5

6、1 mg/L。
　　5.通過(guò)利用MTT法研究?jī)?nèi)生真菌產(chǎn)牡荊苷菌株提取物對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1促進(jìn)增殖的效果，采取牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性對(duì)照，木豆產(chǎn)內(nèi)生真菌粗提物為待測(cè)樣品，結(jié)果如下:產(chǎn)牡荊苷內(nèi)生真菌對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖產(chǎn)生不同程度的影響，從時(shí)間和濃度梯度來(lái)看，藥物濃度為1×10-4μg/mL的內(nèi)生真菌產(chǎn)牡荊苷發(fā)酵液粗提物對(duì)細(xì)胞作用12h時(shí)的增殖效果最顯著，最大增殖率達(dá)到33.46％。
　　本文以木豆植株作為宿主植

7、物，分別從根、莖、葉中分離內(nèi)生真菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定內(nèi)生真菌的種屬分類(lèi);利用HPLC方法篩選出產(chǎn)牡荊苷的內(nèi)生真菌并計(jì)算其產(chǎn)量;通過(guò)響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)牡荊苷內(nèi)生真菌液體培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化;以成骨細(xì)胞MC3T3-E1為體外模型，考察內(nèi)生真菌產(chǎn)牡荊苷菌株對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖率的影響。
　　本研究首次從木豆中獲得了產(chǎn)牡荊苷的內(nèi)生真菌菌株G6和Y3，利用該菌株生產(chǎn)牡荊苷時(shí)間短產(chǎn)量高，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，應(yīng)用前景廣