杜仲葉提取物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞體外作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景: 頜骨可因外傷、腫瘤、炎癥等多種因素而造成骨缺損,頜骨缺損除直接導(dǎo)致顏面畸形外,還可引起嚴(yán)重的功能障礙,給病人造成語言、吞咽等功能的障礙,及在生理、心理、社會(huì)等方面的不良影響.自1912年Macewen報(bào)道利用自體肋骨修復(fù)下頜骨缺損獲得成功以來,各國(guó)學(xué)者在頜骨缺損重建方面進(jìn)行了大量的研究. 頜骨缺損傳統(tǒng)的治療方法主要是骨移植,其中包括自體骨移植、異體、異種骨移植和人工骨代用品.近年來,隨著生物學(xué)和材料科學(xué)的發(fā)展,組

2、織工程學(xué)作為高新技術(shù)新領(lǐng)域的一門多學(xué)科交叉的新興邊緣學(xué)科隨之應(yīng)運(yùn)而生,并得到了迅速的發(fā)展,利用組織工程學(xué)方法構(gòu)建的組織工程骨已成為骨移植的又一研究熱點(diǎn). 杜仲,為杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoids Oliv.)的干燥樹皮,是我國(guó)特有的名貴中藥,中國(guó)藥典規(guī)定其樹皮作為中藥杜仲入藥.杜仲皮一般需生長(zhǎng)15-20年,而葉的資源相對(duì)豐富易得,研究證實(shí)杜仲葉與皮的化學(xué)成分基本一致,具有同等功效,可以以葉代皮<'[1]>,具有補(bǔ)

3、肝、腎、強(qiáng)筋骨等作用.杜仲葉的化學(xué)成分為:1)苯丙素類化合物:包括谷甾醇(13-sistoster01)、熊果酸(ursolicacid)、綠原酸(chlorogenic acid).2)環(huán)烯醚萜類:杜仲醇(eneommiol)、京尼平苷酸(geniposidic acid)、京尼平苷(geniposide)、桃葉珊瑚苷(aucubin).3)黃酮類:山奈酚(kaempferol)、斟皮素(quercetin).<'[2]>研究表明,杜

4、仲葉提取物的有效成分對(duì)成骨細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用<'[3]>. 機(jī)體在外傷等應(yīng)激條件下都會(huì)由超氧化物歧化酶(SOD)、氧化酶等催化產(chǎn)生活性氧(reactive oxygenspecies,ROS),如超氧陰離子(02)、過氧化氫(H202)、羥基自由基(HO·)等<'[4,5]>.這對(duì)于細(xì)胞信號(hào)傳遞、吞噬細(xì)胞的功能及創(chuàng)口愈合的快慢都有重要的作用<'[6]>. 目的: 探討不同濃度的杜仲葉提取物對(duì)體外培養(yǎng)的成

5、骨細(xì)胞增殖作用的影響,并根據(jù)其體外活性測(cè)試的結(jié)果,選擇杜仲葉提取物最佳成骨作用濃度;探討杜仲葉提取物(Euec)對(duì)H<,2>O<,2>誘導(dǎo)所致的成骨細(xì)胞凋亡的抑制作用及其分子機(jī)制. 方法: 通過四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法進(jìn)行紐胞毒性實(shí)驗(yàn),流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),以探討杜仲葉的成骨作用;以H<,2>O<,2>誘導(dǎo)小鼠成骨樣細(xì)胞(MC3T3-E1)氧化損傷,建立細(xì)胞凋亡模型,經(jīng)適當(dāng)濃度Euec的干預(yù),采用Wester

6、n blot,RT-PCR方法測(cè)定細(xì)胞的存活率,細(xì)胞的凋亡率,半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)-3、-6、-7、-9的相關(guān)凋亡蛋白及基因表達(dá).探討Euec對(duì)H<,2>O<,2>所致MC3T3-E1凋亡的抑制作用及其可能的機(jī)制. 結(jié)果: 由實(shí)驗(yàn)可知:800umol/L的H<,2>O<,2>可致使MC3T3-E1細(xì)胞凋亡;杜仲葉提取物(Euec)(6.25ug/ml)可顯著抑制H<,2>O<,2>所致細(xì)胞的氧化

7、損傷,提高細(xì)胞的存活率;可明顯降低細(xì)胞中凋亡細(xì)胞百分比;可抑制半胱氨酰天冬氨酸特異性蛋白酶Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-9的蛋白和基因表達(dá). 結(jié)論: Euec對(duì)MC3T3-E1的增殖有促進(jìn)作用,可以用于骨缺損修復(fù);Euec能明顯抑制H<,2>O<,2>誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞的凋亡作用,減輕MC3T3-E1細(xì)胞的氧化損傷,其機(jī)制可能與抑制Caspase-3、-6、-7、-9