永生化人支氣管上皮細胞惡性轉化過程中不同形態(tài)集落來源細胞的研究.pdf

1、評價化學物致癌性，主要依靠哺乳動物長期誘癌實驗。但其實驗周期長，飼養(yǎng)條件要求嚴格，受試動物的敏感性和給藥劑量常影響實驗結果。而哺乳動物細胞的體外惡性轉化實驗既能反映化學物的致癌性，又能彌補動物誘癌實驗的不足。因此，作為對長期誘癌實驗的補充其結果具有重要參考價值。細胞體外惡性轉化實驗的起始點是致癌物導致細胞遺傳物質改變，終點是細胞成瘤能力的改變，轉化過程中則伴隨有細胞形態(tài)、細胞生長能力、生化表型等的變化。本實驗就以致癌物作用人支氣管上皮細

2、胞后傳代細胞集落的形態(tài)學改變?yōu)榍腥朦c，尋找人源細胞體外轉化的早期形態(tài)學標志，持續(xù)觀察由不同形態(tài)集落而來的兩株細胞隨傳代其生長特性、細胞構成、細胞遺傳物質及細胞成瘤能力的變化，進而探討肺腫瘤組織發(fā)生、人源細胞體外轉化的形態(tài)學標志和基因組學改變等問題。期望建立一種以人源細胞為實驗材料的化學物致癌性評價簡化模型。 本研究在我室袁素波、陳光宇、周拮等人先后進行的賽替派(Thiotepa，TEPA)、環(huán)磷酰胺(Cyclophosphami

3、de，CP)誘發(fā)永生化人支氣管上皮細胞株BEAS-2B惡性轉化、裸鼠接種成瘤及轉化細胞、腫瘤細胞生物學特性和轉化機理研究的基礎上，分別以遺傳毒性致癌物賽替派、絲裂霉素C(MitomycinC，MMC)、環(huán)磷酰胺和非遺傳毒性致癌物6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine，6-MP)、丁基羥甲苯(butylatedhydroxytoluene，BHT)對BEAS-2B細胞進行染毒，克隆接種。一方面觀察比較所產生的集落形態(tài)學上的差異，另

4、一方面以電鏡、免疫細胞化學染色、核型分析、基因芯片、裸鼠接種成瘤等技術對賽替派染毒BEAS-2B后兩種不同形態(tài)集落來源的細胞的生長特性、細胞構成、遺傳物質改變及其致癌性進行研究。主要實驗結果如下： 在遺傳毒性致癌物賽替派、環(huán)磷酰胺和絲裂霉素C染毒BEAS-2B細胞一定時間后，其傳代細胞可形成兩種形態(tài)差異很大的集落(克隆)：一種集落與BEAS-2B細胞集落相似，細胞呈紡錘形、長梭形，胞核卵圓，胞漿少而淡染，細胞排列松散，呈放射狀或

5、略呈車輪狀，我們稱之為松散型集落(S-colony)；另一種集落為數(shù)比較少，胞體大而圓，胞漿豐富，核嗜堿深染，細胞排列緊密，集落呈圓形邊緣向外擴展，局部細胞有復層生長現(xiàn)象，我們稱之為緊湊型集落(C-colony)。而非遺傳毒性致癌物6-巰基嘌呤、丁基羥甲苯作用BEAS-2B后卻無此現(xiàn)象發(fā)生。提示緊湊型集落的產生與細胞遺傳物質的損傷有關聯(lián)。 我們選取賽替派染毒BEAS-2B細胞后產生的兩種不同形態(tài)集落(S-colony和C-col

6、ony)及BEAS-2B細胞，HE染色后，應用Mias-300計算機顯微圖像分析系統(tǒng)測量它們的形態(tài)學參數(shù)，發(fā)現(xiàn)C-colony細胞在核面積、漿面積、周長、等效直徑等方面大于S-colony和BEAS-2B細胞，也圓于這兩種細胞。 把賽替派染毒BEAS-2B細胞后產生的松散型集落和緊湊型集落分離，擴大培養(yǎng)，細胞建株，分別命名為BEAS-S和BEAS-C細胞。它們除在細胞形態(tài)上存在差異外，在細胞生長動力學方面也存在差異。BEAS-2

7、B和BEAS-S細胞生長速率快于BEAS-C細胞，克隆形成率高于BEAS-C細胞，飽和密度大于BEAS-C細胞。但只有BEAS-C細胞中有緊湊型集落和轉化灶產生。BEAS-S、BEAS-C細胞與BEAS-2B細胞相比，G0/G1期細胞減少，S期細胞增加，G2/M期細胞比例在其早代細胞中高于對照細胞，隨著細胞傳代，G2/M期細胞的比例恢復至正常狀態(tài)，但S期細胞比例仍高于對照。 對BEAS-2B、BEAS-S和BEAS-C細胞進行考

8、馬斯蘭染色觀察其細胞骨架，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細胞骨架系統(tǒng)排列有序，無紊亂；BEAS-S細胞骨架系統(tǒng)稍有紊亂，不明顯；而BEAS-C細胞可觀察到骨架系統(tǒng)明顯紊亂。提示賽替派通過對細胞骨架的影響而使細胞形態(tài)、集落形態(tài)發(fā)生變化。對BEAS-C細胞進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)賽替派對人支氣管上皮細胞有明顯細胞毒作用，細胞損傷比較嚴重，部分細胞胞漿、胞核中有空泡，染色質有邊集現(xiàn)象。 使用人支氣管上皮基底細胞特異標志物——角蛋白34βE12抗體、杯狀

9、細胞特異標志物——粘蛋白5AC(Mucin5AC，MUC5AC)抗體和神經(jīng)內分泌細胞特異標志物——嗜鉻素A(ChromograninA，ChrA)抗體對3株細胞進行免疫細胞化學染色(PowerVisionTM兩步法)。發(fā)現(xiàn)在3株細胞中均無ChrA表達；MUC5AC表達為弱陽性；34βE12在BEAS-2B和BEAS-S細胞中表達不隨代齡增加而明顯改變，在BEAS-C細胞，隨著代齡增加，34βE12表達明顯增強。表明基底細胞可能是人支氣管

10、上皮細胞惡性轉化的干細胞。 對3株細胞進行染色體核型分析，發(fā)現(xiàn)BEAS-2B細胞染色體數(shù)目穩(wěn)定，也未見非穩(wěn)定性畸變；而BEAS-S和BEAS-C細胞均可見雙著絲粒染色體和少量染色體斷片，發(fā)生率以BEAS-C3P和BEAS-S32P最高，分別為8％和9％。BEAS-C細胞隨著傳代四倍體的比率逐漸升高，最終成為細胞的主體，而BEAS-S細胞染色體數(shù)目的改變不明顯。每株細胞分析3個核型，其中BEAS-S32P和BEAS-C32P細胞分

11、別有1個和2個核型異常，以BEAS-C細胞異常最為明顯。 使用BiostarH-20s基因芯片對3株細胞部分基因的表達進行兩兩分析比較。將在BEAS-Cvs.BEAS-2B組中出現(xiàn)差異表達的數(shù)據(jù)項篩出，共44項，其中下調基因19個，上調基因25個；將在BEAS-Svs.BEAS-2B組中出現(xiàn)差異表達的數(shù)據(jù)項篩出，共14項，其中下調基因8個，上調基因6個；將在BEAS-Cvs.BEAS-S組中出現(xiàn)差異表達的數(shù)據(jù)項篩出，共181項，

12、其中下調基因53個，上調基因128個。分析結果還顯示BEAS-C細胞在某些與腫瘤相關基因的表達上異于其它兩株細胞。我們從基因芯片實驗結果中選取差異明顯的5條基因CTNNB1、CD44、RHOC、ID3、TGFA通過RT-PCR實驗進行驗證。發(fā)現(xiàn)在它們在3株細胞中的相對含量用兩種方法所測結果大體上一致，但在數(shù)值上有些差別。 BEAS-2B、BEAS-S和BEAS-C細胞在成瘤性上存在差異：PHA(phytohaemagglutin

13、in)凝集實驗中，BEAS-C細胞凝集性明顯強于BEAS-2B和BEAS-S細胞；軟瓊脂集落形成實驗中，BEAS-C細胞在第28代開始長出集落，而BEAS-2B和BEAS-S細胞在軟瓊脂中始終未觀察到集落形成；裸鼠成瘤實驗中只有接種BEAS-C細胞的裸鼠有腫瘤生成。 本研究利用5種致癌物轉化BEAS-2B細胞，并對賽替派轉化BEAS-2B細胞后由不同形態(tài)集落而來的兩株細胞的形態(tài)學、細胞構成、基因組學及成瘤性進行研究，得出以下主要

14、結論：①致癌物→遺傳物質的損傷→細胞骨架系統(tǒng)的紊亂、細胞黏附性的增加→細胞形態(tài)、集落形態(tài)的變異→成瘤性的變異。因此緊湊型集落(C-colony)的出現(xiàn)可作為一個預測化學物是否具有遺傳毒性、致癌性的早期標志，但以此為依據(jù)建立一種以人源細胞為實驗材料的化學物致癌性評價簡化模型還需在更廣泛的基礎上進行研究。②致癌物→細胞群中基底細胞耐受細胞毒作用→受遺傳毒作用誘導突變→獲得生長優(yōu)勢并擴增為惡變細胞群主體，說明基底細胞可能是人支氣管上皮細胞惡性