轉(zhuǎn)染Cx43cDNA對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞侵襲性影響的體外研究.pdf

1、研究背景：
　　 神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤。其侵襲性行為是惡性膠質(zhì)瘤最重要的標(biāo)志之一，使其預(yù)后不良，術(shù)后易復(fù)發(fā)。因此，膠質(zhì)瘤侵襲性研究成為熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞侵入正常組織是一個(gè)多因素參與的過(guò)程，主要包括三個(gè)環(huán)節(jié)：粘附、ECM降解及遷移。MMPs降解ECM，為膠質(zhì)瘤侵襲提供空間。Cx43在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最為豐富，且主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞中；在惡性膠質(zhì)瘤中心，Cx43低表達(dá)，而在腫塊邊緣Cx43高表達(dá)。研究表明，RNA干

2、擾抑制Cx43表達(dá)能抑制肝癌細(xì)胞侵襲，但Cx43與鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞侵襲之間的關(guān)系尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)C6過(guò)表達(dá)Cx43，探討其與C6細(xì)胞侵襲性的關(guān)系及可能的機(jī)制，為臨床防治腦膠質(zhì)瘤提供新的思路和策略。
　　 目的：
　　 將pCMV-Cx43cDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞，上調(diào)C6細(xì)胞Cx43表達(dá)。探討過(guò)表達(dá)Cx43對(duì)腦膠質(zhì)瘤侵襲性的影響及機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、通過(guò)脂

3、質(zhì)體將pCMV-Cx43cDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入C6細(xì)胞，使C6細(xì)胞過(guò)表達(dá)Cx43，并用G418抗性篩選出穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Cx43的C6細(xì)胞。
　　 2、用Western blot及RT-PCR分別檢測(cè)Cx43蛋白及Cx43mRNA表達(dá)。
　　 3、建立體外Transwell侵襲模型聯(lián)合MTT法，觀察Cx43對(duì)C6細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 4、用明膠酶譜法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2、MMP-9活性的強(qiáng)弱。
　　

4、 5、Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功將pCMV-Cx43cDNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C6細(xì)胞，并用G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Cx43基因的細(xì)胞株(C6-Cx43細(xì)胞)及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株(C6-non細(xì)胞)。
　　 2、RT-PCR：C6細(xì)胞、C6-Cx43細(xì)胞及C6-non細(xì)胞Cx43mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為：1.15±0.05、1.86±0.07、1.08±0.05，C6

5、-Cx43細(xì)胞比C6及C6-non細(xì)胞Cx43mRNA表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Western blot：C6細(xì)胞、C6-Cx43細(xì)胞及C6-non細(xì)胞Cx43蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為：0.36±0.06、1.25±0.1、0.31±0.07，C6-Cx43細(xì)胞比C6及C6-non細(xì)胞Cx43蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3、各組細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)結(jié)果顯示C6-Cx43細(xì)胞吸光度

6、值較C6-non、C6細(xì)胞組顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示C6-Cx43細(xì)胞的侵襲能力較C6-non、C6細(xì)胞明顯增強(qiáng)。
　　 4、明膠酶譜法顯示，C6-Cx43細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9活性明顯增強(qiáng)，與C6-non、C6細(xì)胞比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 5、Western blot：C6細(xì)胞、C6-Cx43細(xì)胞及C6-non細(xì)胞MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.29±0.03、0.43±

7、0.02、0.27±0.01，C6-Cx43細(xì)胞比C6、C6-non細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、C6細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pCMV-Cx43cDNA，C6-Cx43細(xì)胞Cx43mRNA及Cx43蛋白表達(dá)明顯增加，C6-Cx43細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　 2、C6細(xì)胞過(guò)表達(dá)Cx43后細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，可能與MMP-9活性增強(qiáng)、MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)有