火龍果對低溫脅迫的生理響應(yīng)及離體誘變篩選抗寒突變體研究.pdf

1、火龍果(Hylocereus undatus Britton&Rose)是仙人掌科多年生攀援性肉莖植物，其果實營養(yǎng)豐富，含有一般植物少有的花青苷和植物白蛋白，以及豐富的維生素和水溶性膳食纖維，具有很高的營養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)價值。溫度是影響火龍果發(fā)展的主要限制因素，有研究表明，火龍果抗寒力較差，溫度低于5℃時火龍果即可能受凍，而0℃是大多數(shù)栽培品種能忍受的最小閾值。貴州等南亞熱帶地區(qū)經(jīng)常遭遇極端天氣（低溫冷害、倒春寒等）的影響，栽培火龍

2、果容易發(fā)生嚴(yán)重冷害和凍害。本研究通過開展火龍果對低溫脅迫的生理響應(yīng)等相關(guān)研究，并通過生物技術(shù)手段離體誘變篩選抗寒突變體，旨在為火龍果的抗寒生理機(jī)制、抗寒新品種選育及尋找提高抗寒性的新途徑提供重要的理論依據(jù)和技術(shù)方案。其主要研究結(jié)果如下:
　　(1)以野生火龍果量天尺(Hylocereus undatus Liangtianchi)和貴州主栽火龍果品種紫紅龍、晶紅龍、粉紅龍成年植株的1年生枝條為試材，測定不同溫度(6、4、2、0、-

3、2、-4和-6℃)處理12h后枝條的電解質(zhì)滲出率(REC)，應(yīng)用Logistic方程計算出半致死溫度(LT50)，并通過恢復(fù)生長試驗進(jìn)行驗證;在LT50下設(shè)置不同處理時間，測定可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量，并進(jìn)行抗寒性分析。結(jié)果表明:火龍果枝條的REC和細(xì)胞膜傷害率(MIP)均隨溫度降低呈“S”型上升，不同火龍果品種的LT50在0.347～-1.031℃之間;在LT50處理下，隨著處理時間的延長，枝條中的

4、可溶性糖、可溶性蛋白及MDA含量均呈逐漸增加的趨勢，而Pro則呈先上升后下降的趨勢?；贚T50及抗寒性相關(guān)生理指標(biāo)分析，初步判斷火龍果抗寒力大小表現(xiàn)為量天尺＞晶紅龍＞粉紅龍＞紫紅龍，這與枝條的恢復(fù)生長試驗結(jié)果及大田表現(xiàn)基本一致。
　　(2)以野生火龍果量天尺和貴州主栽火龍果品種紫紅龍、晶紅龍、粉紅龍的1年生扦插幼苗為試材，人工控溫進(jìn)行抗寒鍛煉、低溫冷害處理及恢復(fù)生長，以未經(jīng)任何處理作對照，測定不同處理下幼苗的REC、可溶性糖、可

5、溶性蛋白、Pro和MDA含量的變化。結(jié)果表明，REC隨溫度降低逐漸增加，恢復(fù)生長后REC與對照之間沒有顯著差別。幼苗中的可溶性糖、可溶性蛋白、Pro及MDA含量在抗寒鍛煉和低溫處理后升高，恢復(fù)生長后又降低。不同處理的可溶性糖和Pro含量變幅較大，MDA和可溶性蛋白含量變幅較小。運用Fuzzy數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)法進(jìn)行抗寒性綜合評價，得出火龍果扦插幼苗的抗寒性強(qiáng)弱表現(xiàn)為量天尺＞晶紅龍＞粉紅龍＞紫紅龍，這與幼苗的恢復(fù)生長試驗結(jié)果基本一致，也與成年

6、火龍果植株的抗寒性鑒定結(jié)果相同。
　　(3)以成年火龍果植株的莖段作為外植體，通過愈傷組織分化成功再生出完整植株。重點研究了外植體表面滅菌方法、不同取樣時間及取樣部位、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及配比、培養(yǎng)條件等對莖段愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及分化的影響。結(jié)果表明，適宜幼嫩莖段表面滅菌的方式為75％的酒精消毒30 s+0.1％的升汞消毒6-8 min，適宜成熟莖段表面滅菌的方式為75％的酒精消毒30 s+0.1％的升汞消毒12-15 min;以

7、春季萌發(fā)的長10-20 cm枝條誘導(dǎo)愈傷組織效果較好，最適愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.4 mg/L+KT0.8 mg/L，暗培養(yǎng)7d，再轉(zhuǎn)入光照培養(yǎng)，愈傷組織為黃綠色、致密狀，外表有顆粒狀突起。愈傷組織增殖培養(yǎng)基以MS+TDZ0.4 mg/L+KT(或ZT)0.8 mg/L效果較好，增殖系數(shù)達(dá)到8倍以上。在愈傷組織分化過程中，添加20-30％的椰子水對不定芽的形成具有一定的促進(jìn)作用，但總體上愈傷分化率較低。
　　(4)以

8、紫紅龍成年植株的莖段作為外植體，直接誘導(dǎo)不定芽再進(jìn)行增殖培養(yǎng)。結(jié)果表明，保留刺座上小刺和絨毛的莖段，其不定芽的誘導(dǎo)率顯著高于拔掉刺座上小刺和絨毛的莖段，而不帶刺座的外植體不定芽誘導(dǎo)率為0。不定芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0 mg/L+NAA0.1-0.2 mg/L，而適宜不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.1-0.2 mg/L+Tryptone750 mg/L。
　　(5)以從紫紅龍成年植株莖

9、段直接培養(yǎng)的無菌苗作為外植體，篩選出適宜火龍果芽苗莖段愈傷誘導(dǎo)和分化的培養(yǎng)基為MS+TDZ0.4 mg/L+2，4-D1.0 mg/L+NAA0.5 mg/L，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到89.1％，且質(zhì)量較好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到94.0％。而最適芽苗生根的培養(yǎng)基為6-BA1.0 mg/L+NAA0.1-0.2 mg/L+CCC0.5-1.0mg/L+AC0.03-0.05％，生根率達(dá)到98％以上;火龍果無菌苗的移栽成活率較高，用珍珠巖+腐殖土(

10、2∶1)和蛭石+腐殖土(1∶1)移栽火龍果無菌苗成活率均達(dá)到100％，且幼苗長勢較好。
　　(6)以無菌條件下培養(yǎng)的單株紫紅龍幼苗為試材，研究了EMS和60Coγ輻照處理及HYP選擇壓對芽苗成活及生長的影響。結(jié)果表明，將叢生芽切割成單株幼苗后繼代培養(yǎng)15-30 d再對其進(jìn)行EMS處理具有較好的適應(yīng)性，以半致死濃度(LC50)和臨界致死濃度(LC40)確定適宜火龍果無菌苗EMS誘變的濃度為3.71-3.95％，處理時間為8.26-9

11、.32 h。低輻照強(qiáng)度(≤15Gy)對無菌苗的成活及分化無明顯影響，隨輻射劑量增大，無菌苗的成活率和分化率顯著降低，且對其生長的抑制作用越明顯。以半致死劑量(LD50)和臨界致死劑量(LD40)確定火龍果無菌苗輻照的適宜劑量范圍為38.5-42.4 Gy。火龍果無菌苗本身能忍受一定濃度(≤8 mmol/L)的HYP，而經(jīng)EMS誘變處理過的無菌苗，在高濃度(20 mmol/L) HYP下的成活率顯著高于未經(jīng)EMS處理的對照植株。
　

12、　(7)無論經(jīng)過EMS或60Coγ誘變與否，火龍果無菌苗的REC和MDA含量均隨溫度降低而明顯增加，而葉綠素和類胡蘿卜素含量則隨溫度降低明顯降低，且溫度越低、持續(xù)時間越長，增加和降低的幅度越大。低溫對無菌苗的可溶性糖、可溶性蛋白和Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響較大，特別是可溶性蛋白含量對溫度的變化更為敏感。各種抗氧化酶(SOD、POD、CAT和APX)活性隨溫度降低和處理時間延長變化規(guī)律不盡一致，但大多數(shù)酶活性在突然遭遇低溫的初期都有一個顯著

13、上升的過程，但隨溫度繼續(xù)下降或低溫時間延長酶活性又逐漸降低。
　　(8)通過抗寒生理初步檢測，經(jīng)EMS或60Coγ輻照處理，并通過HYP篩選后的火龍果無菌苗在不同低溫和同一低溫不同處理時間下均表現(xiàn)出比對照更強(qiáng)的抗寒能力，這可能與誘變處理后植物細(xì)胞產(chǎn)生了一定的抗寒突變體有關(guān)。
　　(9)以EMS誘變初步篩選出的突變體材料10份和60Coγ輻照誘變初步篩選出的突變體材料4份進(jìn)行REC和Pro檢測及ISSR分析，以未經(jīng)任何處理的材

14、料作對照。結(jié)果表明，突變體的REC值較對照均有所降低，其中，5號突變體的REC較對照降幅最大。突變體中的Pro含量均顯著高于對照。其中，5號突變體的Pro含量是對照的6.5倍，這與同一材料的REC鑒定結(jié)果一致，說明其抗寒力最強(qiáng)。利用篩選出9條ISSR引物對15份火龍果材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到67條譜帶，其中多態(tài)性帶的比例為71.64％，說明供試材料的變異較為豐富。引物M06檢測出5號突變體有一條特異譜帶。采用NTSYS pc2.1軟件分析得出